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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请各位大神木虫帮我分析一下WB条带
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)

[求助] 请各位大神木虫帮我分析一下WB条带 已有2人参与

请各位大神木虫帮我分析WB条带

图1 和图2分别是目的蛋白，图3 是GADPH。我解释一下，一抗孵育过夜，然后急着发光看结果，就一抗洗了4次，5min／次。二抗孵育1h。二抗洗3次， 5min／次。发现目的蛋白背景太黑了。是不是也是一抗特异性不强的缘故啊？
多谢各位虫子，虚心请教。

请各位大神木虫帮我分析一下WB条带
屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.45.png


请各位大神木虫帮我分析一下WB条带-1
屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.52.png


请各位大神木虫帮我分析一下WB条带-2
屏幕快照 2015-11-03 下午10.31.13.png
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1楼 2015-11-03 22:35:50
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
我这儿也是失败案例，同样一抗稀释1000倍，4℃结合过夜，但回收重复使用三次。封闭一抗二抗都是用TBST5min/次，重复6次放摇床洗涤。曝光时间10-30都用过，不知道这里是否有问题。敢问楼主曝光多久？我这做出来背景深到整个片子一泡污，焦急分析步骤中……

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9楼2015-11-12 13:39:48
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蛋白小王子6: 金币+15, ★★★很有帮助 2015-11-04 13:38:56
封闭液用的是什么？脱脂奶粉效果比BSA稍好。
    一抗的稀释比例和孵育时间都可以调整一下试试。另外，二抗的孵育时间也可以缩短为30到40分钟试试。
    曝光时间也可以缩短。
    好的结果都是要不断优化实验条件的。

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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
2楼2015-11-03 23:05:08
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
谢谢KeKe226, 我的一抗是1:1000稀释的 孵育时间过夜9h。我的主要问题是背景值太高，优化一抗可以降低背景值么？

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3楼2015-11-04 13:01:15
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 蛋白小王子6 at 2015-11-04 13:01:15
谢谢KeKe226, 我的一抗是1:1000稀释的 孵育时间过夜9h。我的主要问题是背景值太高，优化一抗可以降低背景值么？

过夜是在4℃吗？可以试试一抗稀释到1比1500或2000，一抗浓度低一些会降低一些非特异吸附的。

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蛋白小王子6
读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
4楼2015-11-04 13:07:32
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