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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » 请各位大神木虫帮我分析一下WB条带
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)

[求助] 请各位大神木虫帮我分析一下WB条带 已有2人参与

请各位大神木虫帮我分析WB条带

图1 和图2分别是目的蛋白，图3 是GADPH。我解释一下，一抗孵育过夜，然后急着发光看结果，就一抗洗了4次，5min／次。二抗孵育1h。二抗洗3次， 5min／次。发现目的蛋白背景太黑了。是不是也是一抗特异性不强的缘故啊？
多谢各位虫子，虚心请教。

请各位大神木虫帮我分析一下WB条带
屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.45.png


请各位大神木虫帮我分析一下WB条带-1
屏幕快照 2015-11-03 下午10.29.52.png


请各位大神木虫帮我分析一下WB条带-2
屏幕快照 2015-11-03 下午10.31.13.png
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1楼 2015-11-03 22:35:50
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蛋白小王子6: 金币+15, ★★★很有帮助 2015-11-04 13:38:56
封闭液用的是什么？脱脂奶粉效果比BSA稍好。
    一抗的稀释比例和孵育时间都可以调整一下试试。另外，二抗的孵育时间也可以缩短为30到40分钟试试。
    曝光时间也可以缩短。
    好的结果都是要不断优化实验条件的。

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读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
2楼2015-11-03 23:05:08
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普通回帖

蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
谢谢KeKe226, 我的一抗是1:1000稀释的 孵育时间过夜9h。我的主要问题是背景值太高，优化一抗可以降低背景值么？

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3楼2015-11-04 13:01:15
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keke226

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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3楼: Originally posted by 蛋白小王子6 at 2015-11-04 13:01:15
谢谢KeKe226, 我的一抗是1:1000稀释的 孵育时间过夜9h。我的主要问题是背景值太高，优化一抗可以降低背景值么？

过夜是在4℃吗？可以试试一抗稀释到1比1500或2000，一抗浓度低一些会降低一些非特异吸附的。

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

蛋白小王子6
读书廿年倦写字，如今翻书不识志，若知眷书悔前程，无如渔樵未识时。三年担柴熟山性，三年苦网谙水汹，前程在心自倦舒，识志何用书中清。
4楼2015-11-04 13:07:32
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
送红花一朵
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4楼: Originally posted by keke226 at 2015-11-04 13:07:32
过夜是在4℃吗？可以试试一抗稀释到1比1500或2000，一抗浓度低一些会降低一些非特异吸附的。
...

是4度过夜孵育的 好 多谢你

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5楼2015-11-04 13:38:37
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liweiwaxmc

铜虫 (小有名气)
封闭不完整会增加背景！封闭液用的不好，一抗有可能非特异性结合，背景增加！稀释一抗对降低背景有一定效果！重点看一下封闭步骤和一抗特异性！

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shop112047695.taobao.com（WB耗材全系列）
6楼2015-11-04 21:57:44
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by liweiwaxmc at 2015-11-04 21:57:44
封闭不完整会增加背景！封闭液用的不好，一抗有可能非特异性结合，背景增加！稀释一抗对降低背景有一定效果！重点看一下封闭步骤和一抗特异性！

你好 多谢你的建议，因为内参和目的蛋白是在同一张膜上孵育的，内参没有问题，说明封闭应该不会太差。第二点我挺赞成的。就是一抗可能浓度太高。染了非特异性条带。今天下午和同学讨论了下，他说可能是我的洗膜时间太短了。我记着开组会。一抗 二抗平均洗了3次 每次5min。然后我同学说他洗4-5次 每次10min。 我觉得这个也有关系，谢谢你。

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读书也不必只读纸做的书，山水可以读，云雨可以读，官场可以读，商界可以读，赌徒和妓女也是书，只在家读书，读了书还是书，无异于整日喝酒、打牌和吸烟土。
7楼2015-11-04 23:47:46
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liweiwaxmc

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛋白小王子6 at 2015-11-04 23:47:46
你好 多谢你的建议，因为内参和目的蛋白是在同一张膜上孵育的，内参没有问题，说明封闭应该不会太差。第二点我挺赞成的。就是一抗可能浓度太高。染了非特异性条带。今天下午和同学讨论了下，他说可能是我的洗膜时间 ...

可以尝试多洗几次！洗的时候用摇床！

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8楼2015-11-05 00:15:20
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babysheep963

新虫 (初入文坛)
我这儿也是失败案例，同样一抗稀释1000倍，4℃结合过夜，但回收重复使用三次。封闭一抗二抗都是用TBST5min/次，重复6次放摇床洗涤。曝光时间10-30都用过，不知道这里是否有问题。敢问楼主曝光多久？我这做出来背景深到整个片子一泡污，焦急分析步骤中……

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9楼2015-11-12 13:39:48
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蛋白小王子6

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by babysheep963 at 2015-11-12 13:39:48
我这儿也是失败案例，同样一抗稀释1000倍，4℃结合过夜，但回收重复使用三次。封闭一抗二抗都是用TBST5min/次，重复6次放摇床洗涤。曝光时间10-30都用过，不知道这里是否有问题。敢问楼主曝光多久？我这做出来背景深 ...

收到 先回答你曝光时间的问题 GA的话表达高 曝光10s内足够了，磷酸化的蛋白我最久的曝光了7分钟。
背景值的问题我感觉和摇床洗膜也有关系，要使劲摇，让膜晃起来。

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读书也不必只读纸做的书，山水可以读，云雨可以读，官场可以读，商界可以读，赌徒和妓女也是书，只在家读书，读了书还是书，无异于整日喝酒、打牌和吸烟土。
10楼2015-11-12 13:56:43
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