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董文娟

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助】KpnI 、 NcoI 双酶切(基本解决,谢谢大家)

请问有有没有做过KpnI 、 NcoI 双酶切的
这两酶酶切要注意什么问题? 酶切效果如何?
谢谢

[ Last edited by 董文娟 on 2008-9-12 at 08:38 ]
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renyjzx2008

金虫 (小有名气)

建议使用0.5xK+BSA为反应缓冲液,先用小体系摸实验条件,然后再换用大体系反应。不过还要考虑你买的那个厂家的酶,参照说明书。宝生物公司的产品说明比较全面,请仔细阅读,希望对你有所帮助。
http://www.takara.com.cn/product/2007/a/A-1FH11001.html
http://www.takara.com.cn/product/2007/a/A-2FH11001.html
http://www.takara.com.cn/product/2007/a/A-3FH11001.html
2楼2008-09-08 13:12:57
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chenlong8628

这两种酶的最适buffer并不一样,所以像上面虫友说的选BSA为缓冲液也可以,或者是做两次但酶切(先做一种酶切,然后热灭活之后再做另外一酶切)。这样的话估计会切开的。
3楼2008-09-08 14:10:51
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董文娟

金虫 (小有名气)

谢谢
我看了上海生工(即宝生物)的资料 在K缓冲液中,KpnI 活性很低,是不是要适当延长作用时间?
4楼2008-09-08 21:56:14
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tangtl

木虫 (正式写手)

小木虫潜水者

我做双酶切都是同时切。缓冲液选其中一种。再加BSA。
不过一般手册上是推荐是:双酶切先反应低盐度buffer。后反应高盐度buffer
5楼2008-09-08 22:22:38
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xipha

木虫 (正式写手)

强烈建议分步酶切,如果质粒切不完全做出来单切,假阳性超多
6楼2008-09-09 09:19:30
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

可以切 如果用Promega 双酶切 效率达到75%-100%
7楼2008-09-09 10:20:38
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)

分步酶切吧
ANNA&KEVIN
8楼2008-09-10 05:28:41
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