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足下客

木虫 (正式写手)

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专业: 临床分子生物学检验

[求助] 荧光定量PCR扩增曲线在平台期出现二次扩增的原因已有2人参与

用同样的反应体系检测两种阳参（这里用阳参A和阳参B做标记），两种阳参分开检测时，扩增曲线是正常的，但是在将两种阳参混合后再检测，其中阳参A的扩增曲线在平台期出现了二次扩增，阳参B的扩增曲线还是正常的。本来以为是探针引物设计的问题，两种阳参的扩增出现了交叉反应，所以用扩增阳参A的引物和探针扩增了一下阳参B，是没有任何扩增现象的。现在不知道是什么原因造成的，求高手指点。异常峰型的图片见附件。

混合阳参检测O157.png

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1楼 2015-10-08 13:06:40

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足下客

木虫 (正式写手)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by love_st at 2015-10-09 13:51:30
产品开发本身就包括你的反应体系的选择和优化，不同的热启动酶需要不同的反应系统搭配...

我只能对引物和探针的用量，酶，dNTP，Mg++浓度做出调整，buffer是固定的。现在已经用了热启动dNTP，扩DNA一般都是用的TaqB酶，用热启动酶虽然特异性好，但是扩增效率低。上下游引物浓度已经调整过了，没有用。可能还是与探针引物的设计有关，可能引物探针的特异性就不是很好，而且扩增效率低。跑电泳显示在单检阳参A时电泳条带的亮度要远远弱于单检阳参B时电泳条带的亮度。