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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR扩增曲线在平台期出现二次扩增的原因
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足下客

木虫 (正式写手)

[求助] 荧光定量PCR扩增曲线在平台期出现二次扩增的原因 已有2人参与

用同样的反应体系检测两种阳参（这里用阳参A和阳参B做标记），两种阳参分开检测时，扩增曲线是正常的，但是在将两种阳参混合后再检测，其中阳参A的扩增曲线在平台期出现了二次扩增，阳参B的扩增曲线还是正常的。本来以为是探针引物设计的问题，两种阳参的扩增出现了交叉反应，所以用扩增阳参A的引物和探针扩增了一下阳参B，是没有任何扩增现象的。现在不知道是什么原因造成的，求高手指点。异常峰型的图片见附件。

荧光定量PCR扩增曲线在平台期出现二次扩增的原因
混合阳参检测O157.png
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1楼 2015-10-08 13:06:40
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足下客

木虫 (正式写手)
没有人遇到过这种情况吗？
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2楼2015-10-09 13:34:46
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love_st

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
足下客: 金币+2, ★有帮助, 谢谢你的参与 2015-10-09 13:46:03
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-10-09 17:59:02
有，很可能是你用的酶特异性不够，试着换个别的酶，或者用现有的酶用不同的reaction buffer进行尝试
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3楼2015-10-09 13:37:51
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足下客

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by love_st at 2015-10-09 13:37:51
有，很可能是你用的酶特异性不够，试着换个别的酶，或者用现有的酶用不同的reaction buffer进行尝试

用过热启动酶，单检时峰型就很差，用TaqB酶单检时峰型好。因为我是要做产品开发，所以峰型和灵敏度是很重要的。buffer是我们公司生产部配的，我没办法选择
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4楼2015-10-09 13:45:34
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 足下客 at 2015-10-09 13:45:34
用过热启动酶，单检时峰型就很差，用TaqB酶单检时峰型好。因为我是要做产品开发，所以峰型和灵敏度是很重要的。buffer是我们公司生产部配的，我没办法选择...

产品开发本身就包括你的反应体系的选择和优化，不同的热启动酶需要不同的反应系统搭配
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5楼2015-10-09 13:51:30
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足下客

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by love_st at 2015-10-09 13:51:30
产品开发本身就包括你的反应体系的选择和优化，不同的热启动酶需要不同的反应系统搭配...

我只能对引物和探针的用量，酶，dNTP，Mg++浓度做出调整，buffer是固定的。现在已经用了热启动dNTP，扩DNA一般都是用的TaqB酶，用热启动酶虽然特异性好，但是扩增效率低。上下游引物浓度已经调整过了，没有用。可能还是与探针引物的设计有关，可能引物探针的特异性就不是很好，而且扩增效率低。跑电泳显示在单检阳参A时电泳条带的亮度要远远弱于单检阳参B时电泳条带的亮度。
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6楼2015-10-09 14:37:22
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 足下客 at 2015-10-09 14:37:22
我只能对引物和探针的用量，酶，dNTP，Mg++浓度做出调整，buffer是固定的。现在已经用了热启动dNTP，扩DNA一般都是用的TaqB酶，用热启动酶虽然特异性好，但是扩增效率低。上下游引物浓度已经调整过了，没有用。可能 ...

挺好，在公司里做产品还能有你这样去分析问题的人越来越少了，buffer固定不固定另说，我建议你换些别的buffer去尝试，也算是满足下好奇心，热启动酶用的哪家的，你也可以自己买普通taq+抗体成为热启动酶
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7楼2015-10-09 14:41:46
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足下客

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by love_st at 2015-10-09 14:41:46
挺好，在公司里做产品还能有你这样去分析问题的人越来越少了，buffer固定不固定另说，我建议你换些别的buffer去尝试，也算是满足下好奇心，热启动酶用的哪家的，你也可以自己买普通taq+抗体成为热启动酶...

在公司里限制比较大，原材料要么从生产部领，要么是合成部。我没有权限自己买。你是做分子诊断试剂的吗？感觉你蛮有经验的
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8楼2015-10-09 14:47:00
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real-time

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

信号A和信号B累加的结果
是你加入A和B阳参浓度不一致所致，把两个浓度调整成一样就和你单一的扩增效果一样了
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一步法逆转录RNA多重实时荧光定量PCR课题服务QQ461749807
9楼2015-10-12 09:07:37
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足下客

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by real-time at 2015-10-12 09:07:37
信号A和信号B累加的结果
是你加入A和B阳参浓度不一致所致，把两个浓度调整成一样就和你单一的扩增效果一样了

我用的是不同的通道啊，阳参A是FAM通道，阳参B是HEX通道。我们做分子诊断的，在联检中检测的目标基因的浓度都是不一样的，因为都是用的临床样本啊。又做了两次实验，将混合阳参中阳参B的浓度降低，阳参A的扩增曲线在平台期上扬的差了很多，而且荧光增峰也提高了。怀疑是受到了阳参B的PCR产物的干扰，于是又用阳参B的PCR产物作为模板，然后用阳参A的引物探针进行扩增，结果什么也没扩出来，很是奇怪。怀疑是受到了其它序列的干扰，需要设计新的实验进行验证，现在已经让生物信息组的同事分析序列了，还没收到结果。
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10楼2015-10-12 09:17:18
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