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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助克隆后基因有突变的问题
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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助克隆后基因有突变的问题

大侠们，我正在做一个微生物酶的克隆表达，经测序后发现与该微生物在NCBI中推断的基因序列相比发生了一个突变，导致一个氨基酸也发生改变。请问大家，这个突变是在什么过程中产生的？我该如何解决？
还有，大家pcr都用哪种taq？普通，EX 还是pfu？我用的是最普通的
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1楼 2008-09-03 08:46:33
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
用于做表达的基因扩增最好用pfu酶，尽力避免突变
用pfu扩增一下，如果还是有这个位点的突变的话，应该是你用于扩增的模板本身的原因
【用pfu扩增时不妨重复扩增一次，扩增结果都进行测序，减少pcr过程中的误差】
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2楼2008-09-03 09:08:07
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复
普通taq酶据说是有千分之一的错配几率，如果是taq引起的突变，那最好的方法就是改用其他高保真的DNA聚合酶。很多厂家都有这种合适的酶，主要利用了酶的5‘-3’外切酶活性。
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金币是赌出来的
3楼2008-09-03 09:14:01
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biogefart

木虫 (著名写手)

不一定是克隆的问题

★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
必须排除菌株的差异，我曾经做同一个种的2个地方得到的菌株，基因有约1%的差异。再者只要有生物活性不必考虑点突变吧。
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闹太套
4楼2008-09-03 09:29:37
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
其实细菌里头，就算是同一菌种，基因都有可能有差异的
这是很正常的事情
当然，用普通的rTaq酶扩增，确实有保真性的问题，一般只要循环数不高就没问题
单纯用Pfu等高保真酶来扩增，效率会比较低
现在大多的解决方案是用混合酶
如Takara的Ex Taq和LA Taq都是高保真酶和普通rTaq的混合
保证效率和保真度
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5楼2008-09-03 09:33:43
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
这个氨基酸是不是在你克隆的微生物酶的活性中心或者什么关键部位，一般只要不影响活性的话，有一个点突变也没有什么关系的。继续做下去，看看这个携带点突变的酶有无活性？
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位卑未敢忘忧国。
6楼2008-09-03 09:47:53
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
建议你有LA-Taq （TaKaRa) 扩增能力强 也具有一定的保真能力
如果一开始就从基因组或CDNA中扩，用PFu可能扩增不出来
这种单个碱基的突变是有可能发生的
你看一下峰图是不是由于测序的问题
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7楼2008-09-03 10:02:36
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-12 16:13
氨基酸序列出现问题应该是在PCR时导致的DNA序列突变进而进入氨基酸序列突变的。同意五楼的说法，如果突变氨基酸不在活性中心的话，可以尝试一下是否有活性。如果没有活性，建议你使用Taq与pfu的混合酶，这样即可以对扩增产物的保真度有保证，同时可以保留5‘末端的A.
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8楼2008-09-03 11:42:50
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
也有可能是你的菌和NCBI上的有差别，
我看了一下上边的所有回复，还有一种可能他们都没有提到，那就是在测序过程中也会出现错误，这个发生的几率还是挺大的，一般的做法是测三次；我就碰到过，测错了一个碱基，后来又测了一次就完全正确了！！
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9楼2008-09-03 13:34:28
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clf0803

银虫 (正式写手)
谢谢各位的回复，再请教一下takara的EX-taq和LA-taq的保真性怎么样？pcr产物可以直接TA克隆吗？
还有，大家都用什么软件模拟蛋白的结构？我如何判断突变是否在活性中心？不同来源的酶结构可能会有差异阿
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10楼2008-09-03 19:43:12
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