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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助克隆后基因有突变的问题
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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助克隆后基因有突变的问题

大侠们，我正在做一个微生物酶的克隆表达，经测序后发现与该微生物在NCBI中推断的基因序列相比发生了一个突变，导致一个氨基酸也发生改变。请问大家，这个突变是在什么过程中产生的？我该如何解决？
还有，大家pcr都用哪种taq？普通，EX 还是pfu？我用的是最普通的
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1楼 2008-09-03 08:46:33
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ningluztt

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 7-12 16:13
氨基酸序列出现问题应该是在PCR时导致的DNA序列突变进而进入氨基酸序列突变的。同意五楼的说法，如果突变氨基酸不在活性中心的话，可以尝试一下是否有活性。如果没有活性，建议你使用Taq与pfu的混合酶，这样即可以对扩增产物的保真度有保证，同时可以保留5‘末端的A.
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8楼2008-09-03 11:42:50
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greenspringmi

银虫 (正式写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
用于做表达的基因扩增最好用pfu酶，尽力避免突变
用pfu扩增一下，如果还是有这个位点的突变的话，应该是你用于扩增的模板本身的原因
【用pfu扩增时不妨重复扩增一次，扩增结果都进行测序，减少pcr过程中的误差】
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2楼2008-09-03 09:08:07
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复
普通taq酶据说是有千分之一的错配几率，如果是taq引起的突变，那最好的方法就是改用其他高保真的DNA聚合酶。很多厂家都有这种合适的酶，主要利用了酶的5‘-3’外切酶活性。
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金币是赌出来的
3楼2008-09-03 09:14:01
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biogefart

木虫 (著名写手)

不一定是克隆的问题

★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
必须排除菌株的差异，我曾经做同一个种的2个地方得到的菌株，基因有约1%的差异。再者只要有生物活性不必考虑点突变吧。
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闹太套
4楼2008-09-03 09:29:37
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