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clf0803

银虫 (正式写手)

[交流] 求助克隆后基因有突变的问题

大侠们,我正在做一个微生物酶的克隆表达,经测序后发现与该微生物在NCBI中推断的基因序列相比发生了一个突变,导致一个氨基酸也发生改变。请问大家,这个突变是在什么过程中产生的?我该如何解决?
还有,大家pcr都用哪种taq?普通,EX 还是pfu?我用的是最普通的
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

也有可能是你的菌和NCBI上的有差别,
我看了一下上边的所有回复,还有一种可能他们都没有提到,那就是在测序过程中也会出现错误,这个发生的几率还是挺大的,一般的做法是测三次;我就碰到过,测错了一个碱基,后来又测了一次就完全正确了!!
9楼2008-09-03 13:34:28
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查看全部 14 个回答

greenspringmi

银虫 (正式写手)

★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
用于做表达的基因扩增最好用pfu酶,尽力避免突变
用pfu扩增一下,如果还是有这个位点的突变的话,应该是你用于扩增的模板本身的原因
【用pfu扩增时不妨重复扩增一次,扩增结果都进行测序,减少pcr过程中的误差】
2楼2008-09-03 09:08:07
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户

★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复
普通taq酶据说是有千分之一的错配几率,如果是taq引起的突变,那最好的方法就是改用其他高保真的DNA聚合酶。很多厂家都有这种合适的酶,主要利用了酶的5‘-3’外切酶活性。
金币是赌出来的
3楼2008-09-03 09:14:01
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biogefart

木虫 (著名写手)

不一定是克隆的问题

★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):感谢答复
必须排除菌株的差异,我曾经做同一个种的2个地方得到的菌株,基因有约1%的差异。再者只要有生物活性不必考虑点突变吧。
闹太套
4楼2008-09-03 09:29:37
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