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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请高手指点为什么我这个基因转不进去
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yang-1166

[交流] 请高手指点为什么我这个基因转不进去

大家好，我实验上出了个问题困扰很久，请高手出来指点一下。我试验上要转一个扩增出来的大小8000左右bp的片段到promega 的pGEM-T Easy载体上，扩增出来很清晰，切胶回收也很清晰，酶连用的是promega的连接酶，连接过夜，做转化蓝白斑也长出很多白斑，可是筛选出的质粒大小都不对，切出来的片段才1000bp左右，做了很久都是这样，我都重复n次了，一直不明白原来的片段连不上也算了，连上的1000bp的片段是哪里来的？
我相同的实验步骤连接2000bp的都成功了，就是这个大点儿的片段一直连不上去，有时候明明看很多白斑可筛选出来都不对，真是郁闷，请高手指点一下，不胜感激
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1楼 2008-08-30 20:01:39
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yat

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
用特异引物做PCR鉴定过吗？如果没做可以补一个PCR鉴定实验。
质粒大小从电泳图上看确实会有很大的变化。有一次我的重组质粒应该是10KB大小，可跑出来有20KB的样子。再做酶切验证结果是对的。
酶切验证不对是不是因为你所P的片段有多个相同酶切位点导致出现1000bp的条带。不知道你的酶切验证图上有几条带亮度怎么样。传个图片看看吧。
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做最好的自己，永不放弃！
2楼2008-08-30 20:41:00
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yang-1166

我现在手头没有现成的图，不过跑出来只有两条带，一条是3000bp 就是那个载体的，一条就是1000bp的，也不是非常亮，还没有载体那条亮哪，我连进去的是8000左右的片段，出现八条1000bp的片段，，也太巧合了吧，谢谢楼上的好人
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3楼2008-08-30 20:53:36
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
酶切有时也不是很准确的 我有的载体酶切就切不下来 结果测序就是对的 你可以用特异引物 做PCR鉴定
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4楼2008-08-31 11:28:18
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lipishun

金虫 (小有名气)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
你用的酶在你目的片段上切割位点吗?说不定是3000×2+1000×2=8000也不一定啊
哈哈！
可以用M13引物PCR，如果出来8000的带就可以了！
一般T载体链接8000的片段，效率效率相当低！
而且切胶回收的时候，大片段往往还有小的片段!
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5楼2008-08-31 13:14:31
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yang-1166

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0): 鼓励一下
楼上的这位想法很有意义，我真还没有想过这个。不过我质粒提出来就很小啊，现在我都是提完质粒看一下大小就扔了，我那个载体3000多，基因8000，加起来怎么也要上万，可是质粒才5000多，所以我分析还是出现碎片了，毕竟是个大片段，
回收时我已经尽量小心了，回收后跑胶也只有一条带，所以就算有断裂的也不多，可是，载体一定都优先和那些小的结合了，弃我的大的不顾，好郁闷啊好郁闷，大家有什么好办法吗？我老板说做pcr 测定不准确
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6楼2008-09-01 21:56:38
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xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):斑斑捧场，蓬荜生辉。
像pGEM-T Easy这样的载体装入8000bps的片段的确太大了，呵呵
质粒一般会通过重组等方式切去部分的插入片段，这就是你的转化出来的质粒往往很小。换个载体吧，8k有些困难的。
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位卑未敢忘忧国。
7楼2008-09-02 08:51:11
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shs304

金虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0): 鼓励一下
那个载体3000多，基因8000
可能是难啊
换个载体
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8楼2008-09-02 09:24:22
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yang-1166

哦，谢谢大家的帮忙，我手头倒是还有个载体PMD18-T，不过这个也很小2600多，看他们的说明书上都写着可以连接大片段啊，没想到实际操作起来这么困难，我换换试试，如果还不行就做pcr 检测算了，老板说的也顾不上了，眼看就要写毕业论文了不能再拖了
再次谢谢大家的帮助
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9楼2008-09-02 10:28:55
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boouy

银虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
科隆8000bp的片段相当困难！
建议改用Invitrogen的topo TA克隆系统。
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10楼2008-09-02 12:03:08
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