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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请高手指点为什么我这个基因转不进去
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yang-1166

[交流] 请高手指点为什么我这个基因转不进去

大家好，我实验上出了个问题困扰很久，请高手出来指点一下。我试验上要转一个扩增出来的大小8000左右bp的片段到promega 的pGEM-T Easy载体上，扩增出来很清晰，切胶回收也很清晰，酶连用的是promega的连接酶，连接过夜，做转化蓝白斑也长出很多白斑，可是筛选出的质粒大小都不对，切出来的片段才1000bp左右，做了很久都是这样，我都重复n次了，一直不明白原来的片段连不上也算了，连上的1000bp的片段是哪里来的？
我相同的实验步骤连接2000bp的都成功了，就是这个大点儿的片段一直连不上去，有时候明明看很多白斑可筛选出来都不对，真是郁闷，请高手指点一下，不胜感激
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1楼 2008-08-30 20:01:39
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yang-1166

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0): 鼓励一下
楼上的这位想法很有意义，我真还没有想过这个。不过我质粒提出来就很小啊，现在我都是提完质粒看一下大小就扔了，我那个载体3000多，基因8000，加起来怎么也要上万，可是质粒才5000多，所以我分析还是出现碎片了，毕竟是个大片段，
回收时我已经尽量小心了，回收后跑胶也只有一条带，所以就算有断裂的也不多，可是，载体一定都优先和那些小的结合了，弃我的大的不顾，好郁闷啊好郁闷，大家有什么好办法吗？我老板说做pcr 测定不准确
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6楼2008-09-01 21:56:38
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yat

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
用特异引物做PCR鉴定过吗？如果没做可以补一个PCR鉴定实验。
质粒大小从电泳图上看确实会有很大的变化。有一次我的重组质粒应该是10KB大小，可跑出来有20KB的样子。再做酶切验证结果是对的。
酶切验证不对是不是因为你所P的片段有多个相同酶切位点导致出现1000bp的条带。不知道你的酶切验证图上有几条带亮度怎么样。传个图片看看吧。
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做最好的自己，永不放弃！
2楼2008-08-30 20:41:00
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yang-1166

我现在手头没有现成的图，不过跑出来只有两条带，一条是3000bp 就是那个载体的，一条就是1000bp的，也不是非常亮，还没有载体那条亮哪，我连进去的是8000左右的片段，出现八条1000bp的片段，，也太巧合了吧，谢谢楼上的好人
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3楼2008-08-30 20:53:36
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
酶切有时也不是很准确的 我有的载体酶切就切不下来 结果测序就是对的 你可以用特异引物 做PCR鉴定
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4楼2008-08-31 11:28:18
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