24小时热门版块排行榜    

查看: 384  |  回复: 9
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

yang-1166

[交流] 请高手指点为什么我这个基因转不进去

大家好,我实验上出了个问题困扰很久,请高手出来指点一下。我试验上要转一个扩增出来的大小8000左右bp的片段到promega 的pGEM-T Easy载体上,扩增出来很清晰,切胶回收也很清晰,酶连用的是promega的连接酶,连接过夜,做转化蓝白斑也长出很多白斑,可是筛选出的质粒大小都不对,切出来的片段才1000bp左右,做了很久都是这样,我都重复n次了,一直不明白原来的片段连不上也算了,连上的1000bp的片段是哪里来的?
我相同的实验步骤连接2000bp的都成功了,就是这个大点儿的片段一直连不上去,有时候明明看很多白斑可筛选出来都不对,真是郁闷,请高手指点一下,不胜感激
回复此楼

» 猜你喜欢

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xyklmu

至尊木虫 (知名作家)

虫眼看世界

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):斑斑捧场,蓬荜生辉。
像pGEM-T Easy这样的载体装入8000bps的片段的确太大了,呵呵
质粒一般会通过重组等方式切去部分的插入片段,这就是你的转化出来的质粒往往很小。换个载体吧,8k有些困难的。
位卑未敢忘忧国。
7楼2008-09-02 08:51:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

yat

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
用特异引物做PCR鉴定过吗?如果没做可以补一个PCR鉴定实验。
质粒大小从电泳图上看确实会有很大的变化。有一次我的重组质粒应该是10KB大小,可跑出来有20KB的样子。再做酶切验证结果是对的。
酶切验证不对是不是因为你所P的片段有多个相同酶切位点导致出现1000bp的条带。不知道你的酶切验证图上有几条带亮度怎么样。传个图片看看吧。
做最好的自己,永不放弃!
2楼2008-08-30 20:41:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yang-1166

我现在手头没有现成的图,不过跑出来只有两条带,一条是3000bp 就是那个载体的,一条就是1000bp的,也不是非常亮,还没有载体那条亮哪,我连进去的是8000左右的片段,出现八条1000bp的片段,,也太巧合了吧,谢谢楼上的好人
3楼2008-08-30 20:53:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
酶切有时也不是很准确的 我有的载体酶切就切不下来 结果测序就是对的 你可以用特异引物 做PCR鉴定
4楼2008-08-31 11:28:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +4 kulium 2026-08-21 5/250 2026-08-21 17:45 by Equinoxhua
[基金申请] 看来今天不会放榜了? +8 chengyan1220 2026-08-21 10/500 2026-08-21 17:32 by chengyan1220
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 让我中一个面上吧! +11 大萍1987 2026-08-20 13/650 2026-08-21 14:48 by 20120902066
[基金申请] 今日不放榜?网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +15 医学老男孩 2026-08-20 18/900 2026-08-21 13:46 by 医学老男孩
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +7 angus9576 2026-08-17 12/600 2026-08-21 13:38 by weiyin
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 什么时候开奖? +7 CrisMessi 2026-08-18 7/350 2026-08-21 12:15 by weiyin
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +15 archvillain 2026-08-15 27/1350 2026-08-21 11:32 by tim76
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 今天系统多次维护,明天很可能放榜! +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 重要消息,中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低?主要原因有哪些? +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜吗? +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 快农历七夕节了,轻松一下,男人悄悄话,女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 明天放榜? +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[精细化工] 招聘 金属平磨液,抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
信息提示
请填处理意见