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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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yang-1166

[交流] 请高手指点为什么我这个基因转不进去

大家好,我实验上出了个问题困扰很久,请高手出来指点一下。我试验上要转一个扩增出来的大小8000左右bp的片段到promega 的pGEM-T Easy载体上,扩增出来很清晰,切胶回收也很清晰,酶连用的是promega的连接酶,连接过夜,做转化蓝白斑也长出很多白斑,可是筛选出的质粒大小都不对,切出来的片段才1000bp左右,做了很久都是这样,我都重复n次了,一直不明白原来的片段连不上也算了,连上的1000bp的片段是哪里来的?
我相同的实验步骤连接2000bp的都成功了,就是这个大点儿的片段一直连不上去,有时候明明看很多白斑可筛选出来都不对,真是郁闷,请高手指点一下,不胜感激
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boouy

银虫 (正式写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
科隆8000bp的片段相当困难!
建议改用Invitrogen的topo TA克隆系统。
10楼2008-09-02 12:03:08
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yat

金虫 (小有名气)

★ ★ ★ ★
reasonspare(金币+4,VIP+0):thx
用特异引物做PCR鉴定过吗?如果没做可以补一个PCR鉴定实验。
质粒大小从电泳图上看确实会有很大的变化。有一次我的重组质粒应该是10KB大小,可跑出来有20KB的样子。再做酶切验证结果是对的。
酶切验证不对是不是因为你所P的片段有多个相同酶切位点导致出现1000bp的条带。不知道你的酶切验证图上有几条带亮度怎么样。传个图片看看吧。
做最好的自己,永不放弃!
2楼2008-08-30 20:41:00
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yang-1166

我现在手头没有现成的图,不过跑出来只有两条带,一条是3000bp 就是那个载体的,一条就是1000bp的,也不是非常亮,还没有载体那条亮哪,我连进去的是8000左右的片段,出现八条1000bp的片段,,也太巧合了吧,谢谢楼上的好人
3楼2008-08-30 20:53:36
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
酶切有时也不是很准确的 我有的载体酶切就切不下来 结果测序就是对的 你可以用特异引物 做PCR鉴定
4楼2008-08-31 11:28:18
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