24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 6318  |  回复: 14

wollysam

金虫 (初入文坛)

[求助] Xba1和Kpn1双酶切 已有4人参与

想要将目的基因用潮霉素替换掉,上游下游片段各1KB,上游片段加了Kpn1和Xba1的酶切位点,上游片段连入了T载体中,做双酶切,却切不开,上游引物
Up-f2:ggggtaccGGTCGTCAATCTCGTCATT  Kpn1
Up-r2:gctctagaAGACGAAGAGAACAAAGGC  Xba1
大家帮我看看是什么问题,内切酶用的Thermo的快速内切酶
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:12:55
wollysam: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-09-24 15:51:21
不是甲基化的问题。你试试用T载体的通用引物测序,看看酶切位点处有没有突变?
2楼2015-09-19 18:42:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wollysam

金虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-09-19 18:42:14
不是甲基化的问题。你试试用T载体的通用引物测序,看看酶切位点处有没有突变?

你好,我用的高保真酶,也会突变吗?
3楼2015-09-19 21:20:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肥猫p

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wollysam at 2015-09-19 21:20:45
你好,我用的高保真酶,也会突变吗?...

与PCR酶没有关系,我是想看看酶切位点处是不是连接的时候出了些突变。一开始看见你帖子,我第一想到的是甲基化,但是发现并不是甲基化的原因。所以只要测序看看了,用T载体上的通用引物测序,就可以看到你酶切位点处的序列是不是正常。
4楼2015-09-20 09:03:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangminglei

新虫 (初入文坛)

用taq酶PCR的话可以直接跟T载体连接,就不用酶切了。
5楼2015-09-20 14:47:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:14:14
连t载体后测序过没有?
6楼2015-09-20 23:09:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zardi

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:14:22
加保护碱基了吗?
7楼2015-09-22 10:38:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zardi

金虫 (初入文坛)

sorry。。没看见你连了T载了。。
8楼2015-09-22 10:39:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangtzelv

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

先测序,看看序列情况。如果基因插入正确,酶切时间适当延长。不要相信快速酶所谓的15min就OK。切个1-2h是有必要的。
9楼2015-09-22 21:48:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

万能的种子

新虫 (初入文坛)

可以尝试把XbaI这个酶切位点换了,用其它酶切位点试试。我以前构建载体的时候,XbaI的效率就不高,反复做了好几次都不行,换了之后立马就好了。
10楼2015-09-22 22:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wollysam 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 327求调剂 +26 Xxjc1107. 2026-04-13 29/1450 2026-04-16 10:52 by Espannnnnol
[考研] 307中医考研调剂 +5 于以采蘩 2026-04-14 5/250 2026-04-16 10:40 by dick_runner
[考研] 291求调剂 +8 关忆北. 2026-04-14 8/400 2026-04-16 10:14 by beilsong20
[考研] 生物学调剂 +9 纸扇zhishan 2026-04-13 9/450 2026-04-15 18:28 by AN流800
[考研] 材料工程281还有调剂机会吗 +43 xaw. 2026-04-11 44/2200 2026-04-15 12:46 by 西北望—风沙
[考研] 272分材料子求调剂 +41 Loy0361 2026-04-10 54/2700 2026-04-14 18:00 by lhj2009
[考研] 085500求调剂材料 +11 易11122 2026-04-09 11/550 2026-04-14 17:59 by lhj2009
[考研] 297求调剂 +23 ORCHID1 2026-04-10 26/1300 2026-04-14 13:52 by 陈皮皮
[考研] 农学0904 312求调剂 +4 Say Never 2026-04-11 4/200 2026-04-14 09:10 by zs92450
[考研] 材料复试求调剂 +24 xhhdjdjsjks 2026-04-09 24/1200 2026-04-13 15:49 by 幸免 ..
[教师之家] 山东双非院校考核超级无底线,领导幸灾乐祸,教师遭殃恐 +3 qut2026 2026-04-11 7/350 2026-04-12 20:24 by qut2026
[考研] 307求调剂 +10 tzq94092 2026-04-10 10/500 2026-04-12 08:18 by wise999
[考研] 调剂求助 +6 果然有我 2026-04-11 7/350 2026-04-11 16:22 by 明月此时有
[考研] 求调剂,一志愿大连理工大学354分 +5 雨声余生 2026-04-11 6/300 2026-04-11 16:12 by 雨声余生
[考研] 本人女孩 +7 吼吼, 2026-04-10 9/450 2026-04-11 14:45 by ACS Nano——
[考研] 一志愿北理工298英一数二已上岸,感谢各位老师 +14 Reframe 2026-04-10 16/800 2026-04-10 23:07 by caotw2020
[考研] 调剂 +12 卷卷卷心菜_ 2026-04-09 13/650 2026-04-10 22:36 by Ftglcn90
[考研] 22408 366分,本科211,一志愿西工大 +4 Rubt 2026-04-09 4/200 2026-04-10 19:51 by chemisry
[考研] 本9 一志愿西工大085601 324求调剂 +5 wysyjs25 2026-04-10 5/250 2026-04-10 16:57 by luoyongfeng
[考研] 机械专368 有去处吗 +4 种大树 2026-04-10 4/200 2026-04-10 15:31 by jiajinhpu
信息提示
请填处理意见