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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Xba1和Kpn1双酶切
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wollysam

金虫 (初入文坛)

[求助] Xba1和Kpn1双酶切 已有4人参与

想要将目的基因用潮霉素替换掉，上游下游片段各1KB，上游片段加了Kpn1和Xba1的酶切位点，上游片段连入了T载体中，做双酶切，却切不开，上游引物
Up-f2：ggggtaccGGTCGTCAATCTCGTCATT  Kpn1
Up-r2：gctctagaAGACGAAGAGAACAAAGGC  Xba1
大家帮我看看是什么问题，内切酶用的Thermo的快速内切酶
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1楼 2015-09-19 10:58:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:12:55
wollysam: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-09-24 15:51:21
不是甲基化的问题。你试试用T载体的通用引物测序，看看酶切位点处有没有突变？
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2楼2015-09-19 18:42:14
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普通回帖

wollysam

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-09-19 18:42:14
不是甲基化的问题。你试试用T载体的通用引物测序，看看酶切位点处有没有突变？

你好，我用的高保真酶，也会突变吗？
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3楼2015-09-19 21:20:45
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肥猫p

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wollysam at 2015-09-19 21:20:45
你好，我用的高保真酶，也会突变吗？...

与PCR酶没有关系，我是想看看酶切位点处是不是连接的时候出了些突变。一开始看见你帖子，我第一想到的是甲基化，但是发现并不是甲基化的原因。所以只要测序看看了，用T载体上的通用引物测序，就可以看到你酶切位点处的序列是不是正常。
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4楼2015-09-20 09:03:36
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zhangminglei

新虫 (初入文坛)
用taq酶PCR的话可以直接跟T载体连接，就不用酶切了。
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5楼2015-09-20 14:47:01
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XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:14:14
连t载体后测序过没有？
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6楼2015-09-20 23:09:41
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zardi

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:14:22
加保护碱基了吗？
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7楼2015-09-22 10:38:03
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zardi

金虫 (初入文坛)
sorry。。没看见你连了T载了。。
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8楼2015-09-22 10:39:26
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yangtzelv

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

先测序，看看序列情况。如果基因插入正确，酶切时间适当延长。不要相信快速酶所谓的15min就OK。切个1-2h是有必要的。
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9楼2015-09-22 21:48:49
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万能的种子

新虫 (初入文坛)
可以尝试把XbaI这个酶切位点换了，用其它酶切位点试试。我以前构建载体的时候，XbaI的效率就不高，反复做了好几次都不行，换了之后立马就好了。
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10楼2015-09-22 22:40:04
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