应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » Xba1和Kpn1双酶切
151/2返回列表12下一页
查看: 6483  |  回复: 14
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wollysam

金虫 (初入文坛)

[求助] Xba1和Kpn1双酶切 已有4人参与

想要将目的基因用潮霉素替换掉，上游下游片段各1KB，上游片段加了Kpn1和Xba1的酶切位点，上游片段连入了T载体中，做双酶切，却切不开，上游引物
Up-f2：ggggtaccGGTCGTCAATCTCGTCATT  Kpn1
Up-r2：gctctagaAGACGAAGAGAACAAAGGC  Xba1
大家帮我看看是什么问题，内切酶用的Thermo的快速内切酶
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2015-09-19 10:58:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

肥猫p

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:12:55
wollysam: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-09-24 15:51:21
不是甲基化的问题。你试试用T载体的通用引物测序，看看酶切位点处有没有突变？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2015-09-19 18:42:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

wollysam

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 肥猫p at 2015-09-19 18:42:14
不是甲基化的问题。你试试用T载体的通用引物测序，看看酶切位点处有没有突变？

你好，我用的高保真酶，也会突变吗？
赞一下 回复此楼
3楼2015-09-19 21:20:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

肥猫p

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wollysam at 2015-09-19 21:20:45
你好，我用的高保真酶，也会突变吗？...

与PCR酶没有关系，我是想看看酶切位点处是不是连接的时候出了些突变。一开始看见你帖子，我第一想到的是甲基化，但是发现并不是甲基化的原因。所以只要测序看看了，用T载体上的通用引物测序，就可以看到你酶切位点处的序列是不是正常。
赞一下 回复此楼
4楼2015-09-20 09:03:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhangminglei

新虫 (初入文坛)
用taq酶PCR的话可以直接跟T载体连接，就不用酶切了。
赞一下 回复此楼
5楼2015-09-20 14:47:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

XOooZzz

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:14:14
连t载体后测序过没有？
赞一下 回复此楼
6楼2015-09-20 23:09:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zardi

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-09-22 12:14:22
加保护碱基了吗？
赞一下 回复此楼
7楼2015-09-22 10:38:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zardi

金虫 (初入文坛)
sorry。。没看见你连了T载了。。
赞一下 回复此楼
8楼2015-09-22 10:39:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yangtzelv

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

先测序，看看序列情况。如果基因插入正确，酶切时间适当延长。不要相信快速酶所谓的15min就OK。切个1-2h是有必要的。
赞一下 回复此楼
9楼2015-09-22 21:48:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

万能的种子

新虫 (初入文坛)
可以尝试把XbaI这个酶切位点换了，用其它酶切位点试试。我以前构建载体的时候，XbaI的效率就不高，反复做了好几次都不行，换了之后立马就好了。
赞一下 回复此楼
10楼2015-09-22 22:40:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wollysam 的主题更新
151/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +5 瞬息宇宙 2026-08-31 5/250 2026-09-02 10:13 by 雨冰共舞
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +17 晴天加油 2026-08-26 19/950 2026-09-02 10:07 by 奶奶的心意
[基金申请] 科研人应该花精力去思考如何解决问题，而不是去凝练问题 +3 瞬息宇宙 2026-09-01 5/250 2026-09-02 08:01 by anjeeshine
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 8/400 2026-09-02 02:42 by Leogzhya
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +5 bjdxyxy 2026-08-26 5/250 2026-09-01 17:54 by 小伟大博士
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +7 gdd2018 2026-08-28 12/600 2026-09-01 08:32 by 尼古拉斯小虫
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭