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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 原核表达相关
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)

[求助] 原核表达相关 已有3人参与

各位大牛，我在做茶树AMP脱氨酶的原核表达，请问：
1. 为了弄清大肠杆菌本身是否含有该酶，我该怎么去做？比如查资料怎么查？
2.如果大肠杆菌含有该酶，测酶活时怎么样做，能确保是原核表达出来的酶，而不是菌本身含有的酶？
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1楼 2015-09-15 14:40:24
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)
大家快帮帮我吧
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2楼2015-09-15 17:07:31
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Deng_Cheng: 金币+2, ★有帮助 2015-10-12 11:20:22
不用这么麻烦啊，你如果是想通过原核蛋白表达纯化得到这个蛋白，给这个蛋白加上标签就可以了啊。
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
3楼2015-09-16 09:25:04
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Deng_Cheng: 金币+4, ★有帮助 2015-10-12 11:21:05
你首先找到你那个酶的基因序列,然后blast一下,分析一下大肠杆菌里面有没有?然后再选择载体,载体上有标签,如28a载体,his标签,纯化出来以后,测酶活就行。

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4楼2015-09-16 09:30:00
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bright8 at 2015-09-16 09:30:00
你首先找到你那个酶的基因序列,然后blast一下,分析一下大肠杆菌里面有没有?然后再选择载体,载体上有标签,如28a载体,his标签,纯化出来以后,测酶活就行。

1.blast后，怎么分析大肠杆菌里面有没有？
2.若大肠杆菌含有该酶， 如何确保酶活不是大肠杆菌里酶的作用？
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5楼2015-09-16 10:55:43
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-09-16 09:25:04
不用这么麻烦啊，你如果是想通过原核蛋白表达纯化得到这个蛋白，给这个蛋白加上标签就可以了啊。

麻烦再仔细看一下我的问题。。。
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6楼2015-09-16 10:57:14
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Deng_Cheng: 金币+4, ★有帮助 2015-10-12 11:21:36
引用回帖:
6楼: Originally posted by Deng_Cheng at 2015-09-16 10:57:14
麻烦再仔细看一下我的问题。。。...

你的酶表达出来后，是要先纯化出来然后再测酶活的，而不能直接拿细菌或者细菌破碎产物测酶活。所以细菌本身有没有同功能的酶影响都不大，反正你都要先分离你的目的酶。楼上说的加标签是方便你纯化，这个建议很好啊。
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7楼2015-09-16 11:29:45
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Deng_Cheng at 2015-09-16 10:55:43
1.blast后，怎么分析大肠杆菌里面有没有？
2.若大肠杆菌含有该酶， 如何确保酶活不是大肠杆菌里酶的作用？...

你以前没有做过blast的么？没有了解重组载体的么？建议你先了解这些基本知识!

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8楼2015-09-16 11:40:22
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuderong at 2015-09-16 11:29:45
你的酶表达出来后，是要先纯化出来然后再测酶活的，而不能直接拿细菌或者细菌破碎产物测酶活。所以细菌本身有没有同功能的酶影响都不大，反正你都要先分离你的目的酶。楼上说的加标签是方便你纯化，这个建议很好啊 ...

能不能不纯化，超声破碎后然后用液相测酶活？因为这样不就省去纯化的步骤了吗？这样是不是要先搞清大肠杆菌内是否含有该酶？
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9楼2015-09-17 15:31:41
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by Deng_Cheng at 2015-09-17 15:31:41
能不能不纯化，超声破碎后然后用液相测酶活？因为这样不就省去纯化的步骤了吗？这样是不是要先搞清大肠杆菌内是否含有该酶？...

必须要纯化出来才行，不然结果不可信。首先破碎液含细菌总蛋白，一般情况下你随便往里头加一个底物应该都会有反应；其次你没有办法定量总蛋白中目的蛋白的量，假设一个检测体系要加入1U的酶，你无法确定要加多少体积的破碎液，即使你做实验摸索过要加多少，但破碎液里有蛋白酶之类的会造成其他蛋白降解的成分，放置一两天后之前摸索的条件就不成立了；再就是每一次实验得到的破碎液成分都不一样，假设第一次实验破碎液里有A\B\C\D这4种蛋白，含量占总量的25%，那第二次有可能A占30%，B占15%，这种差异使得每次实验收到的干扰都不同。
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10楼2015-09-17 16:20:51
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