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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)

[求助] 原核表达相关 已有3人参与

各位大牛,我在做茶树AMP脱氨酶的原核表达,请问:
1. 为了弄清大肠杆菌本身是否含有该酶,我该怎么去做?比如查资料怎么查?
2.如果大肠杆菌含有该酶,测酶活时怎么样做,能确保是原核表达出来的酶,而不是菌本身含有的酶?
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by Deng_Cheng at 2015-09-17 15:31:41
能不能不纯化,超声破碎后然后用液相测酶活?因为这样不就省去纯化的步骤了吗?这样是不是要先搞清大肠杆菌内是否含有该酶?...

必须要纯化出来才行,不然结果不可信。首先破碎液含细菌总蛋白,一般情况下你随便往里头加一个底物应该都会有反应;其次你没有办法定量总蛋白中目的蛋白的量,假设一个检测体系要加入1U的酶,你无法确定要加多少体积的破碎液,即使你做实验摸索过要加多少,但破碎液里有蛋白酶之类的会造成其他蛋白降解的成分,放置一两天后之前摸索的条件就不成立了;再就是每一次实验得到的破碎液成分都不一样,假设第一次实验破碎液里有A\B\C\D这4种蛋白,含量占总量的25%,那第二次有可能A占30%,B占15%,这种差异使得每次实验收到的干扰都不同。
10楼2015-09-17 16:20:51
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Deng_Cheng

铁虫 (小有名气)

大家快帮帮我吧
2楼2015-09-15 17:07:31
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Deng_Cheng: 金币+2, 有帮助 2015-10-12 11:20:22
不用这么麻烦啊,你如果是想通过原核蛋白表达纯化得到这个蛋白,给这个蛋白加上标签就可以了啊。
早上一副睡不醒的样子,下午一副没睡醒的样子,晚上一副打了鸡血的样子!
3楼2015-09-16 09:25:04
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bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Deng_Cheng: 金币+4, 有帮助 2015-10-12 11:21:05
你首先找到你那个酶的基因序列,然后blast一下,分析一下大肠杆菌里面有没有?然后再选择载体,载体上有标签,如28a载体,his标签,纯化出来以后,测酶活就行。

发自小木虫Android客户端
4楼2015-09-16 09:30:00
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