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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助关于原核表达包涵体纯化的问题？
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王希lily

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助关于原核表达包涵体纯化的问题？ 已有5人参与

本人是新手，最近在做原核表达，表达载体为PET32，做到蛋白纯化时，优化条件后发现蛋白老是表达在沉淀中，所以需用尿素将包涵体溶解挂柱纯化，但做到包涵体洗涤液（含2M尿素）洗涤时发现蛋白变成胶冻状，根本没办法继续用8M尿素溶解，更不用说上柱纯化了，我将包涵体洗涤液洗涤的上清跑SDS-PAGE，发现有少部分目的条带。之后我又直接用8M尿素溶解，上清跑SDS-PAGE，发现几乎没有目的条带。急求哪位大神能给点意见，为什么包涵体洗涤液会将蛋白洗成胶冻状？
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1楼 2015-09-14 10:54:14
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穿白大褂约会

禁言 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-09-14 23:08:16
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4楼2015-09-14 22:17:31
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hc-material

专家顾问 (职业作家)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-09-14 23:07:38
可以尝试用用6M盐酸胍,可尝试加少量EDTA .试试先不行在讨论。另外也可以尝试低温诱导，比如25度，尝试让其可溶性表达。
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2楼2015-09-14 14:46:22
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王希lily

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by hc-material at 2015-09-14 14:46:22
可以尝试用用6M盐酸胍,可尝试加少量EDTA .试试先不行在讨论。另外也可以尝试低温诱导，比如25度，尝试让其可溶性表达。

嗯，我做优化的时候做了20度的，几乎都表达在沉淀呢，所以只有想办法溶包涵体了，我试试盐酸胍呢，谢谢了
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3楼2015-09-14 16:06:48
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王希lily

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 穿白大褂约会 at 2015-09-14 22:17:31
这种情况我也出现过，2M尿素就变成胶冻状吗？看来应该很好复性的。建议：1.使用Benzonase代替超声，如果非用超声建议频率调低，时间缩短。2.可以直接用6M尿素溶解，过柱纯化，纯化之后再复性。3.如果6M尿素不能溶解 ...

好的，我试试，谢谢

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5楼2015-09-15 00:26:33
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
★
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包涵体我觉得比较好纯化的，，收集菌体后 充分破碎，，多用包涵体洗涤液洗洗几次，，然后离心收集沉淀就是包涵体，，一般纯度还可以。
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6楼2015-09-15 11:02:50
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王希lily

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by viki_MDK at 2015-09-15 11:02:50
包涵体我觉得比较好纯化的，，收集菌体后 充分破碎，，多用包涵体洗涤液洗洗几次，，然后离心收集沉淀就是包涵体，，一般纯度还可以。

问题是包涵体洗就变果冻状了，根本没法做纯化！

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7楼2015-09-15 15:05:08
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
★
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降低尿素试一试嘛
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8楼2015-09-16 08:09:56
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baleful

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
菌体内的核酸超声后形成了胶质，包涵体可以先用2M Nacl 洗涤下在溶解，8M 脲不行就用6M 盐酸胍
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9楼2015-09-17 15:05:15
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王希lily

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by baleful at 2015-09-17 15:05:15
菌体内的核酸超声后形成了胶质，包涵体可以先用2M Nacl 洗涤下在溶解，8M 脲不行就用6M 盐酸胍

谢谢，我先试试

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10楼2015-09-17 16:40:30
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