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阳光---阳光

新虫 (初入文坛)

[交流] 基因原核表达载体的构建

连接转化后,目的基因在菌液中PCR可以得到,条带大小1600bp左右,正是目的基因。可是菌液提质粒后PCR只能P出2000bp和2000多bp的单一条带(不同泳道),这是为什么呢?大肠杆菌本身也没有我的目的基因。

这个是质粒PCR的图片,条带大小已经不是我的目的基因了。
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renzhiq

木虫 (小有名气)

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阳光---阳光: 金币+4, 哦,好的,谢谢! 2015-09-14 09:14:17
你的菌液pcr的条带太淡,很可能是假阳性……pcr条件不太适合,需重新调整……

发自小木虫Android客户端
9楼2015-09-13 21:47:28
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

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阳光---阳光: 金币+4, 我都分别跑了,有Marker比对着 2015-09-13 16:40:22
跑一个菌液PCR和质粒PCR在一块胶的图看看先。
2楼2015-09-13 15:23:34
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zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)

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阳光---阳光: 金币+5, 恩,跑过了,酶切切出了一条更大的条带,还有一条和原来一样大的,不知道为什么 2015-09-13 17:01:07
在同一胶上,跑一个酶切前后对比
3楼2015-09-13 15:27:31
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naringenin

新虫 (小有名气)

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阳光---阳光: 金币+2, 是啊,我点的样品也比较少,5微升 2015-09-13 17:01:39
质粒PCR条带这么淡啊,比marker还淡。
4楼2015-09-13 15:31:10
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naringenin

新虫 (小有名气)

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阳光---阳光: 金币+5, 好的,我再试试,谢谢! 2015-09-13 20:02:32
内切酶双切质粒,电泳看长度是不是和理论能对的上,对不上的话肯定不对。对上了的话,然后用质粒上的引物测序(如T7,sp6)确认就ok了,双向测序基本能搞定全长。不必纠结于pcr的长度。
5楼2015-09-13 17:34:12
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)

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阳光---阳光: 金币+2, 恩恩,谢谢! 2015-09-13 20:04:16
的确,双酶切后再跑胶也可以,不要过于相信marker的指示。
6楼2015-09-13 18:15:41
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7楼2015-09-13 18:35:41
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枭翔

金虫 (正式写手)

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阳光---阳光: 金币+1, 是啊,不知道为什么 2015-09-14 09:13:51
你的菌落PCR的条带是不是很弱?
8楼2015-09-13 21:09:25
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

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阳光---阳光: 金币+5, 恩,我再重新试试,谢谢! 2015-09-14 09:15:10
你是不是用目的基因的引物进行的菌液PCR?如果是的话,那么菌液PCR100%假阳性。。。后面质粒跑的结果看似乎都是载体吧,因为载体加入量少,所以很淡,而由于没有插入片段,所以引物几乎都以单体或者二聚体存在,所以引物带很亮,而模板带(加的空载质粒)比较弱。我猜的。。。
10楼2015-09-13 23:22:21
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