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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 基因原核表达载体的构建
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阳光---阳光

新虫 (初入文坛)

[交流] 基因原核表达载体的构建

连接转化后，目的基因在菌液中PCR可以得到，条带大小1600bp左右，正是目的基因。可是菌液提质粒后PCR只能P出2000bp和2000多bp的单一条带（不同泳道），这是为什么呢？大肠杆菌本身也没有我的目的基因。

这个是质粒PCR的图片，条带大小已经不是我的目的基因了。
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人的潜力是无限的！
1楼 2015-09-13 15:06:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

renzhiq

木虫 (小有名气)
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阳光---阳光: 金币+4, 哦，好的，谢谢！ 2015-09-14 09:14:17
你的菌液pcr的条带太淡，很可能是假阳性……pcr条件不太适合，需重新调整……

发自小木虫Android客户端
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9楼2015-09-13 21:47:28
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)
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阳光---阳光: 金币+4, 我都分别跑了，有Marker比对着 2015-09-13 16:40:22
跑一个菌液PCR和质粒PCR在一块胶的图看看先。
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2楼2015-09-13 15:23:34
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普通回帖

zhenwuhuang

至尊木虫 (文学泰斗)
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阳光---阳光: 金币+5, 恩，跑过了，酶切切出了一条更大的条带，还有一条和原来一样大的，不知道为什么 2015-09-13 17:01:07
在同一胶上，跑一个酶切前后对比
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3楼2015-09-13 15:27:31
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naringenin

新虫 (小有名气)
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阳光---阳光: 金币+2, 是啊，我点的样品也比较少，5微升 2015-09-13 17:01:39
质粒PCR条带这么淡啊，比marker还淡。
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4楼2015-09-13 15:31:10
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naringenin

新虫 (小有名气)
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阳光---阳光: 金币+5, 好的，我再试试，谢谢！ 2015-09-13 20:02:32
内切酶双切质粒，电泳看长度是不是和理论能对的上，对不上的话肯定不对。对上了的话，然后用质粒上的引物测序（如T7，sp6）确认就ok了，双向测序基本能搞定全长。不必纠结于pcr的长度。
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5楼2015-09-13 17:34:12
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)
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阳光---阳光: 金币+2, 恩恩，谢谢！ 2015-09-13 20:04:16
的确，双酶切后再跑胶也可以，不要过于相信marker的指示。
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6楼2015-09-13 18:15:41
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stl409
7楼2015-09-13 18:35:41
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枭翔

金虫 (正式写手)
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阳光---阳光: 金币+1, 是啊，不知道为什么 2015-09-14 09:13:51
你的菌落PCR的条带是不是很弱？
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8楼2015-09-13 21:09:25
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
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阳光---阳光: 金币+5, 恩，我再重新试试，谢谢！ 2015-09-14 09:15:10
你是不是用目的基因的引物进行的菌液PCR？如果是的话，那么菌液PCR100%假阳性。。。后面质粒跑的结果看似乎都是载体吧，因为载体加入量少，所以很淡，而由于没有插入片段，所以引物几乎都以单体或者二聚体存在，所以引物带很亮，而模板带（加的空载质粒）比较弱。我猜的。。。
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10楼2015-09-13 23:22:21
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