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5150416

新虫 (小有名气)

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专业: 纳米医学

[交流] PCR目的基因

问一下大家在PCR时候有没有遇到像我这样的情况，就是怎么p就是p不出来，引物是重新换的，还是p不出来，你们将退货温度调到比设计的高多少或少多少，大家有木有好的方法，还请大家给个建议，谢谢！

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1楼 2015-09-06 15:34:06

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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

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专业: 抗体工程学

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
5150416: 金币+5 2015-09-07 09:53:40

哎~
首先确定你的模板有没有降解，提取多长时间了
其次引物不是换新的就可以的，引物特异性需要验证
然后关于酶，不知道你的目的片段大小多少，GC含量如何，建议先看看如何选酶根据大小和下游应用选择 http://www.detaibio.com/dna-taq-polymerase.html，一般的热启动聚合酶能够满足扩增，
最好按照酶的说明书设置反应条件和配置反应体系，一般不是一次成功的话，摸索退火温度，如果杂带多，升高退火温度如果没有条带可降低退火温度，另外根据目的片段大小配置合适胶浓度，，，太多了具体的看看一下文档吧有问题解决和提高特异性的方法总结，还有一篇是关于操作的，有很多注意的点 http://www.detaibio.com/topics/pcr-sop.html
http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html