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5150416

新虫 (小有名气)

[交流] PCR目的基因

问一下大家在PCR时候有没有遇到像我这样的情况，就是怎么p就是p不出来，引物是重新换的，还是p不出来，你们将退货温度调到比设计的高多少或少多少，大家有木有好的方法，还请大家给个建议，谢谢！

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1楼 2015-09-06 15:34:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chenyuanxmc

金虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
退火温度:55-65，有段时间我的pcr也是怎么也p不出来，后来加大了模板浓度，才过得pcr产物，或者更换好一点的酶试试。

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4楼2015-09-07 07:51:25
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
5150416: 金币+5 2015-09-07 09:53:40
哎~
首先确定你的模板有没有降解，提取多长时间了
其次引物不是换新的就可以的，引物特异性需要验证
然后关于酶，不知道你的目的片段大小多少，GC含量如何，建议先看看如何选酶根据大小和下游应用选择 http://www.detaibio.com/dna-taq-polymerase.html，一般的热启动聚合酶能够满足扩增，
最好按照酶的说明书设置反应条件和配置反应体系，一般不是一次成功的话，摸索退火温度，如果杂带多，升高退火温度如果没有条带可降低退火温度，另外根据目的片段大小配置合适胶浓度，，，太多了具体的看看一下文档吧 有问题解决和提高特异性的方法总结，还有一篇是关于操作的，有很多注意的点 http://www.detaibio.com/topics/pcr-sop.html
http://www.detaibio.com/topics/pcr-faq-specific-amplify.html
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5150416
todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
6楼2015-09-07 09:36:02
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普通回帖

jl.liu

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
建议使用梯度PCR设置线性梯度温度进行退火，找出最适的退火温度。还有就是你的反应体系是怎么的，也有关系，可能是引物不好，或者模板加太多了。
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2楼2015-09-07 00:32:16
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阿Q~~

至尊木虫 (文坛精英)
路过的看了一下，帮顶，祝福你好运！~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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自强不息，厚德载物；独立精神，自由思想。
3楼2015-09-07 07:25:16
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nianmo0599

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
模板的质量也很重要，还有换好点的酶试试

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5楼2015-09-07 08:55:33
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5150416

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 阿Q~~ at 2015-09-07 07:25:16
路过的看了一下，帮顶，祝福你好运！~~~~~~~~~~~~~~~~~~

谢谢

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7楼2015-09-07 09:54:22
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5150416

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by 18761615793 at 2015-09-07 09:36:02
哎~
首先确定你的模板有没有降解，提取多长时间了
其次引物不是换新的就可以的，引物特异性需要验证
然后关于酶，不知道你的目的片段大小多少，GC含量如何，建议先看看如何选酶根据大小和下游应用选择 http://ww ...

谢谢

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8楼2015-09-07 09:54:31
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5150416

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by nianmo0599 at 2015-09-07 08:55:33
模板的质量也很重要，还有换好点的酶试试

都换了，可是还是不行，现在还是在摸索温度

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9楼2015-09-07 09:55:21
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5150416

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by chenyuanxmc at 2015-09-07 07:51:25
退火温度:55-65，有段时间我的pcr也是怎么也p不出来，后来加大了模板浓度，才过得pcr产物，或者更换好一点的酶试试。

好的，谢谢

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10楼2015-09-07 09:55:48
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