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枭翔

金虫 (正式写手)

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有没有别的非特异性条带？如果有的话，说明退火温度不合适；如果没有的话，那就不是退火温度的原因。引物看看有没有设计错误，尤其是反向引物，一般引物的质量没问题。你的模板是什么？gDNA?质粒？还是片段？PCR体系中加入5-10%的DMSO试一试。
祝试验顺利！

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11楼2015-09-07 10:39:56

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5150416

新虫 (小有名气)

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有带但是不对应，用的是CDMA，也调试过很多温度

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12楼2015-09-07 10:54:23

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nianmo0599

新虫 (初入文坛)

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引用回帖:

9楼: Originally posted by 5150416 at 2015-09-07 09:55:21
都换了，可是还是不行，现在还是在摸索温度
...

我的经验是模板好的话随便设计两对引物试几个温度就出来了，我一般先用55，扩不出来就用62，64试一下。如果模板不好，试再多温度也白搭。还有可以考虑重新设计引物，不要用primer等设计软件，因为评分再高也不一定说明其特异性好，我都是随便乱选的引物。额～个人意见，仅供参考。

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13楼2015-09-07 11:34:51

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5150416

新虫 (小有名气)

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嗯，好的，谢谢

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14楼2015-09-07 13:09:32

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赵鑫易

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1.退火温度，用梯度PCR仪多试几次，没有的话多台一起跑。
2.模板浓度，多试几次
3.退火时间
4.试试两步PCR
5.实在不行就换酶
最重要的是记录清楚！！！变量与结果,避免无意义的重复

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15楼2015-09-07 14:00:10

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5150416

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引用回帖:

15楼: Originally posted by 赵鑫易 at 2015-09-07 14:00:10
1.退火温度，用梯度PCR仪多试几次，没有的话多台一起跑。
2.模板浓度，多试几次
3.退火时间
4.试试两步PCR
5.实在不行就换酶
最重要的是记录清楚！！！变量与结果,避免无意义的重复

好的，谢谢

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16楼2015-09-07 15:34:26

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