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lianfeng1107

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
27楼: Originally posted by 吗子 at 2015-09-05 20:34:36
已经降低了的...

要是还不行可以试一下OMEGA PCR 的方法。
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  • 附件 1 : Ω_-_PCR_protocol__protocol_(2013-4-5_Version).doc
    • 2015-09-05 22:49:30, 231.5 K
31楼2015-09-05 22:49:32
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397608492

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
直接无缝克隆，这种问题如果一星期内不解决就要换方法了。祝好运

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32楼2015-09-06 00:58:43
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顾在

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5, 因为片段从T载体上切下来就是用着两个酶，同样表达载体也是用这两个酶切的，作了单酶切的对照都切开了的。部分酶切是怎么弄的呢？ 2015-09-08 22:52:09
是否有其他酶切位点可以选择呢？若有最好换酶切位点，之前有遇到过一个载体就是连接不上，但是换一个酶切位点就好连了，你也可以试用其它公司的高效率的连接酶连接下；一定要排除酶切不彻底和试剂问题，排除后可以试试分部酶切，再连接～

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33楼2015-09-06 06:02:00
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阿Q~~

至尊木虫 (文坛精英)
★
吗子: 金币+1, 谢谢 2015-09-08 22:52:32
路过的看了一下，帮顶，祝福你好运！~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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自强不息，厚德载物；独立精神，自由思想。
34楼2015-09-06 06:46:45
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海绵船长

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+1, 老板让亲自做，后面还有差不多十个载体要构建呢。想想快奔溃了 2015-09-08 22:53:26
找公司，这种连好了给你最多花几百块就好了。

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35楼2015-09-06 07:07:27
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Eternity宇

禁虫 (著名写手)
★
吗子: 金币+1, 谢谢 2015-09-08 22:53:44
本帖内容被屏蔽
36楼2015-09-06 07:10:19
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mzhyan

至尊木虫 (文坛精英)
★
吗子: 金币+1 2015-09-08 22:54:00
blessing
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37楼2015-09-06 08:19:53
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mengyuzc

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+1, 正打算换NEB的酶呢，片段有250bp,表达载体有10000+bp，1ul的载体可能会有点少吧 2015-09-06 19:18:55
可是试试NEB的T4连接酶 有个高浓度的 我一般做连接用20ul体系 载体1ul 目的16ul 其他是buffer和1ul酶

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38楼2015-09-06 08:55:04
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-字仲康

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+3, 嗯，前面酶切都切开了；转化一般24小时后才长出菌落，挑了培养做PCR验证无阳性，问题出在没有连接成功。抗生素，板，抗性基因还在，转化方法没有问题，做了转化对照的。应该是假阳性。对载体进行磷酸化怎么操作？原理是什么呢？谢谢解答 2015-09-06 19:23:34
本帖内容被屏蔽
39楼2015-09-06 11:47:18
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Tama二等兵

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
29楼: Originally posted by 吗子 at 2015-09-05 20:40:54
具体怎么做呢

载体双切开，片段两端加上重叠序列，重组酶重组就好
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40楼2015-09-06 20:15:06
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