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吗子金虫 (小有名气)
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[交流]
做质粒重组的虫友们请看这
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小弟最近一直在构建载体，用的是限制性酶切克隆，之前已顺利构建了一个载体。 但是最近将另一个基因连接于表达载体上的时候，目的基因已经获得并已纯化，表达载体也切开并纯化了， 连接的时候换了各种连接比例，但结果一直是连接不上（用的TAKARA的T4连接酶），已经连续近三个月失败，几近奔溃。亦被老板嫌弃多次。。。 在查了一些资料及请教了一些前辈之后，他们建议选择其他克隆方式，比如无缝连接(In-Fusion Cloning),好像还有相应的重组KIT。 我也打算试试了，不能一棵树上吊死啊。 现抽空发帖与各位做重组的虫友们交流讨论，做得好的，希望大家分享宝贵经验；和我一样苦逼做不出来的也希望互相学习，都是为了试验顺利。  关于质粒重组的好方法希望大家多多发表下宝贵意见吧。50金币大家不要嫌少。。。。 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5, 因为片段从T载体上切下来就是用着两个酶，同样表达载体也是用这两个酶切的，作了单酶切的对照都切开了的。部分酶切是怎么弄的呢？ 2015-09-08 22:52:09
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5, 因为片段从T载体上切下来就是用着两个酶，同样表达载体也是用这两个酶切的，作了单酶切的对照都切开了的。部分酶切是怎么弄的呢？ 2015-09-08 22:52:09
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是否有其他酶切位点可以选择呢？若有最好换酶切位点，之前有遇到过一个载体就是连接不上，但是换一个酶切位点就好连了，你也可以试用其它公司的高效率的连接酶连接下；一定要排除酶切不彻底和试剂问题，排除后可以试试分部酶切，再连接～ 发自小木虫Android客户端 |
33楼2015-09-06 06:02:00
假大空
木虫之王 (文学泰斗)
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7楼2015-09-02 16:51:21
chenyuanxmc
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
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插入片段和载体的浓度稍微大点进行连接，后期用pcr筛选，祝顺利 发自小木虫Android客户端 |
10楼2015-09-02 16:57:41
13楼2015-09-02 17:26:58
