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吗子金虫 (小有名气)
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[交流]
做质粒重组的虫友们请看这
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小弟最近一直在构建载体，用的是限制性酶切克隆，之前已顺利构建了一个载体。 但是最近将另一个基因连接于表达载体上的时候，目的基因已经获得并已纯化，表达载体也切开并纯化了， 连接的时候换了各种连接比例，但结果一直是连接不上（用的TAKARA的T4连接酶），已经连续近三个月失败，几近奔溃。亦被老板嫌弃多次。。。 在查了一些资料及请教了一些前辈之后，他们建议选择其他克隆方式，比如无缝连接(In-Fusion Cloning),好像还有相应的重组KIT。 我也打算试试了，不能一棵树上吊死啊。 现抽空发帖与各位做重组的虫友们交流讨论，做得好的，希望大家分享宝贵经验；和我一样苦逼做不出来的也希望互相学习，都是为了试验顺利。  关于质粒重组的好方法希望大家多多发表下宝贵意见吧。50金币大家不要嫌少。。。。 |
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+3, 嗯，前面酶切都切开了；转化一般24小时后才长出菌落，挑了培养做PCR验证无阳性，问题出在没有连接成功。抗生素，板，抗性基因还在，转化方法没有问题，做了转化对照的。应该是假阳性。对载体进行磷酸化怎么操作？原理是什么呢？谢谢解答 2015-09-06 19:23:34
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+3, 嗯，前面酶切都切开了；转化一般24小时后才长出菌落，挑了培养做PCR验证无阳性，问题出在没有连接成功。抗生素，板，抗性基因还在，转化方法没有问题，做了转化对照的。应该是假阳性。对载体进行磷酸化怎么操作？原理是什么呢？谢谢解答 2015-09-06 19:23:34
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39楼2015-09-06 11:47:18
假大空
木虫之王 (文学泰斗)
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7楼2015-09-02 16:51:21
chenyuanxmc
金虫 (著名写手)
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
吗子: 金币+5 2015-09-05 20:39:23
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插入片段和载体的浓度稍微大点进行连接，后期用pcr筛选，祝顺利 发自小木虫Android客户端 |
10楼2015-09-02 16:57:41
13楼2015-09-02 17:26:58
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