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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 对奇异变形杆菌中基因进行敲除
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周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 对奇异变形杆菌中基因进行敲除 已有2人参与

对奇异变形杆菌中基因进行敲除，最后对克隆进行PCR验证，无论是菌落还是菌液，还是煮沸后的上清，都不能P出条带？求助原因或方法
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1楼 2015-09-02 14:14:32
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
对最后够好的重组质粒P不出条带吗？
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2楼2015-09-02 15:22:56
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周志惠

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by xrxleisure at 2015-09-02 15:22:56
对最后够好的重组质粒P不出条带吗？

不是，是对将重组质粒电转进去，然后去抗性平板上的菌P不出，并且以一开始的野生型菌为模板，也P不出
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3楼2015-09-02 16:00:16
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园园许

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 周志惠 at 2015-09-02 16:00:16
不是，是对将重组质粒电转进去，然后去抗性平板上的菌P不出，并且以一开始的野生型菌为模板，也P不出...

是不是引物出问题了，或者是温度不合适？你做的是菌落PCR，所以所扩增的片段不会太长，你试试用质量较高的模板扩增一下。一般菌落PCR扩增片段超过3k就不容易扩增了。你有没有做重复，PCR仪有时候也存在不稳定性，还有确定PCR体系配制的完整性。
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高兴是一天，苦恼也是一天，何以？
4楼2015-09-05 16:34:14
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周志惠

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 园园许 at 2015-09-05 16:34:14
是不是引物出问题了，或者是温度不合适？你做的是菌落PCR，所以所扩增的片段不会太长，你试试用质量较高的模板扩增一下。一般菌落PCR扩增片段超过3k就不容易扩增了。你有没有做重复，PCR仪有时候也存在不稳定性，还 ...

之前用提的基因组是能P出来的，用菌液或者菌落做过好几次，都没有P出来
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5楼2015-09-06 11:16:36
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
不要菌落PCR，建议提基因组DNA，然后用DNA做模板，进行PCR验证
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6楼2015-09-06 12:44:13
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周志惠

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biosci at 2015-09-06 12:44:13
不要菌落PCR，建议提基因组DNA，然后用DNA做模板，进行PCR验证

嗯，准备提DNA了，主要是觉得这个菌是阴性菌，理论上用菌液或者菌落是能P出来的啊
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7楼2015-09-06 14:19:13
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
周志惠: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2015-09-07 07:48:07
不好说，有可能拷贝数少，或者胞内有抑制PCR反应的物质
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8楼2015-09-06 17:03:13
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