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周志惠

新虫 (小有名气)

[求助] 对奇异变形杆菌中基因进行敲除 已有2人参与

对奇异变形杆菌中基因进行敲除,最后对克隆进行PCR验证,无论是菌落还是菌液,还是煮沸后的上清,都不能P出条带?求助原因或方法
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xrxleisure

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
对最后够好的重组质粒P不出条带吗?
2楼2015-09-02 15:22:56
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周志惠

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by xrxleisure at 2015-09-02 15:22:56
对最后够好的重组质粒P不出条带吗?

不是,是对将重组质粒电转进去,然后去抗性平板上的菌P不出,并且以一开始的野生型菌为模板,也P不出
3楼2015-09-02 16:00:16
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园园许

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 周志惠 at 2015-09-02 16:00:16
不是,是对将重组质粒电转进去,然后去抗性平板上的菌P不出,并且以一开始的野生型菌为模板,也P不出...

是不是引物出问题了,或者是温度不合适?你做的是菌落PCR,所以所扩增的片段不会太长,你试试用质量较高的模板扩增一下。一般菌落PCR扩增片段超过3k就不容易扩增了。你有没有做重复,PCR仪有时候也存在不稳定性,还有确定PCR体系配制的完整性。
高兴是一天,苦恼也是一天,何以?
4楼2015-09-05 16:34:14
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周志惠

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 园园许 at 2015-09-05 16:34:14
是不是引物出问题了,或者是温度不合适?你做的是菌落PCR,所以所扩增的片段不会太长,你试试用质量较高的模板扩增一下。一般菌落PCR扩增片段超过3k就不容易扩增了。你有没有做重复,PCR仪有时候也存在不稳定性,还 ...

之前用提的基因组是能P出来的,用菌液或者菌落做过好几次,都没有P出来
5楼2015-09-06 11:16:36
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


【答案】应助回帖

商家已经主动声明此回帖可能含有宣传内容
不要菌落PCR,建议提基因组DNA,然后用DNA做模板,进行PCR验证
6楼2015-09-06 12:44:13
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周志惠

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by biosci at 2015-09-06 12:44:13
不要菌落PCR,建议提基因组DNA,然后用DNA做模板,进行PCR验证

嗯,准备提DNA了,主要是觉得这个菌是阴性菌,理论上用菌液或者菌落是能P出来的啊
7楼2015-09-06 14:19:13
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)


【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
周志惠: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2015-09-07 07:48:07
不好说,有可能拷贝数少,或者胞内有抑制PCR反应的物质
8楼2015-09-06 17:03:13
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