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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 实验讨论 » 荧光定量目的基因复孔的重复性不好，而内参基因重复性却很好。急求大神帮忙。
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长虎牙的羊

金虫 (小有名气)

[求助] 荧光定量目的基因复孔的重复性不好，而内参基因重复性却很好。急求大神帮忙。

小的我最近在重复师姐做的荧光定量的实验，但是换了一种细胞系（都是人的细胞，我用的是HepG2），之前的细胞系已经验证过引物是没有问题的。我连着做了三遍，结果就是目的基因的重复性非常不好。昨天又做了一遍，结果还是酱紫，oh，我的内心是奔溃的！！！！！！所用试剂应该没有问题，都是新买的PROMEGA的试剂，RNA是用omega试剂盒提的，260/280为2.07。请各位大神帮帮我吧。
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1楼 2015-08-31 09:56:08
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长虎牙的羊

金虫 (小有名气)
2楼2015-09-01 22:08:07
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wozaitianda

禁虫 (小有名气)
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长虎牙的羊
3楼2015-09-01 22:51:42
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长虎牙的羊

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by wozaitianda at 2015-09-01 22:51:42
换一下引物试试。

谢谢你回我，引物之前做过都没问题。现在找到原因了，是我做DNA酶没消化好，都降解了，但是我现在也不知道原因，因为同样的步骤我师妹做就没问题，我师妹跟我一起做同样的RNA也没问题，我的就不知道为什么，所以想等段时间再做，估计最近有点衰！
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4楼2015-09-06 08:50:36
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jackyoung

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

从比值看，RNA完整性应该可以接受（如果是nanodrop测定的话，分光光度计法得到这样的值多半是降解的）。有一点需要确定，即所说的重复是实验重复还是技术重复？如果是实验重复，建议考虑优化提取-反转录过程（指控制好RNA质量和反应体系中样品的用量，同一批次进行实验，消除可能的影响），重新定量后取均值即可，如果变异大可能是正常的。另外告诉你几个事实:1.cDNA多次冻融或存放时间较长会引起降解（尤其反转录后没有热失活RT的）;2.RNA的质量和投入多少会影响反转的效率，尤其是各种细节控制不好（多加或少加，混合不均匀，有影响酶活性的酒精、酚、胍等存在的时候）;3.仪器的问题（之前是公共仪器，某几个个别位置甚至整排有问题，小概率）
问题可能千奇百怪，知道原理，懂得避免，尽量靠谱就好。祝好。

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长虎牙的羊
CestLaVie
5楼2015-09-11 01:06:40
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长虎牙的羊

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by jackyoung at 2015-09-11 01:06:40
从比值看，RNA完整性应该可以接受（如果是nanodrop测定的话，分光光度计法得到这样的值多半是降解的）。有一点需要确定，即所说的重复是实验重复还是技术重复？如果是实验重复，建议考虑优化提取-反转录过程（指控制 ...

谢谢了，摸索了很久，还是做不好，我暂时搁搁这实验。260/280是正常的也不能代表RNA的完整性，我后面跑胶发现有的RNA降解了，我估计是试剂盒被污染了吧，我下次用TRIZOL试一试。
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6楼2015-09-13 09:43:59
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js2008wjw

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

Promega有一款柱膜法的RNA纯化试剂盒，LS1040，纯化出的RNA纯度和完整性都比trizol好。促销价350￥
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长虎牙的羊
7楼2015-09-15 22:25:52
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长虎牙的羊

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by js2008wjw at 2015-09-15 22:25:52
Promega有一款柱膜法的RNA纯化试剂盒，LS1040，纯化出的RNA纯度和完整性都比trizol好。促销价350￥

谢谢了
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8楼2015-09-16 21:09:55
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葛中凯

金虫 (正式写手)
我觉得可能是有基因组污染

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只有想不到的，没有做不到的！
9楼2019-02-03 00:18:34
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dingdongbel


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10楼2019-02-03 01:34:52
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