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[求助]
荧光定量目的基因复孔的重复性不好，而内参基因重复性却很好。急求大神帮忙。
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| 小的我最近在重复师姐做的荧光定量的实验，但是换了一种细胞系（都是人的细胞，我用的是HepG2），之前的细胞系已经验证过引物是没有问题的。我连着做了三遍，结果就是目的基因的重复性非常不好。昨天又做了一遍，结果还是酱紫，oh，我的内心是奔溃的！！！！！！所用试剂应该没有问题，都是新买的PROMEGA的试剂，RNA是用omega试剂盒提的，260/280为2.07。请各位大神帮帮我吧。 |
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wozaitianda
禁虫 (小有名气)
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长虎牙的羊3楼2015-09-01 22:51:42
4楼2015-09-06 08:50:36
jackyoung
新虫 (正式写手)
- 博学EPI: 1
- 应助: 9 (幼儿园)
- 金币: 3507.7
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- 帖子: 670
- 在线: 91.7小时
- 虫号: 799178
- 注册: 2009-06-26
- 性别: GG
- 专业: 园艺学与植物营养学
【答案】应助回帖
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从比值看，RNA完整性应该可以接受（如果是nanodrop测定的话，分光光度计法得到这样的值多半是降解的）。有一点需要确定，即所说的重复是实验重复还是技术重复？如果是实验重复，建议考虑优化提取-反转录过程（指控制好RNA质量和反应体系中样品的用量，同一批次进行实验，消除可能的影响），重新定量后取均值即可，如果变异大可能是正常的。另外告诉你几个事实:1.cDNA多次冻融或存放时间较长会引起降解（尤其反转录后没有热失活RT的）;2.RNA的质量和投入多少会影响反转的效率，尤其是各种细节控制不好（多加或少加，混合不均匀，有影响酶活性的酒精、酚、胍等存在的时候）;3.仪器的问题（之前是公共仪器，某几个个别位置甚至整排有问题，小概率） 问题可能千奇百怪，知道原理，懂得避免，尽量靠谱就好。祝好。 发自小木虫Android客户端 |
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5楼2015-09-11 01:06:40
6楼2015-09-13 09:43:59
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