应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 分子clone之小白求助篇
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 706  |  回复: 2
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

无心之感

金虫 (正式写手)

紫霄洞洞主

[求助] 分子clone之小白求助篇 已有2人参与

本菜鸟最近遇到个顽固的作死cloning，硬生生死活连不上呐。你到底要闹哪样。此处省略吐槽字样一千。。

进入正题：

问题描述：准备构建一个某蛋白定位载体，准备连接的片段有两个：该基因自身的Promoter（长约2K），Genomic（长约3K）测序都没问题；载体是pCAMBIA1301附带有EGFP序列（常用的植物表达载体）。双酶切回收后，使用T4 liagse（TaKaRa公司的）。反应体系如下：

T4 liagse....................... 2 ul
Promote片段................10ul
Genomic 片段................10ul
pCAMBIA 1301.............. 4ul
T4 buffer...................... 3ul
反应温度: 常温； 反应时间：4h， 然后转化。

但是。。 问题来了。为嘛它就是连不上捏。。 片段双酶切回收没有问题，酶切后1301空载也不长，说明载体已经切开了。难道是T4酶的问题？ 别的我也想不到了。
欢迎来和我讨论帮忙解决问题！欢迎提供新的方法（如此最好）！但凡有益，即发赏赐～
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
天下风云出我辈，一入江湖岁月催，皇图霸业谈笑中，不胜人生一场醉！
1楼 2015-08-26 11:40:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

string1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
无心之感: 金币+1, ★有帮助, 赏你一个金币，为嘛不能发0.5个呢 2015-08-26 13:46:56
实在不行就一个一个来呗，同时连就是效率低。最好16度过夜。
赞一下 回复此楼
现在的志向是一个文艺技术男，远大的志向是一个气质理论教授
3楼2015-08-26 12:47:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 3 个回答

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无心之感: 金币+5, ★有帮助, 值得借鉴的方法 2015-08-26 13:47:25
首先看看有没有拿错盘了 有时糊涂了抗生素用错

然后这种三个片段连的，一般比两个片段连的困难一点

我们实验室一般会先把两个短的室温连个2-3小时，然后把最长的加进去（一般是载体）4度连一晚上

还有可以做个T4的阳性对照，确保你的酶没有问题

在或者换个菌株试试？祝你成功
赞一下 回复此楼
2楼2015-08-26 11:48:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 3 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂 +11 张zz111 2026-03-27 12/600 2026-04-02 22:47 by JourneyLucky
[考研] 土木水利328分求调剂 +4 疾风知劲草666 2026-04-02 4/200 2026-04-02 21:59 by barlinike
[考研] 考研调剂 +3 李木子0120 2026-04-02 5/250 2026-04-02 21:45 by dongzh2009
[考研] 296求调剂 +4 sdhu 2026-04-02 4/200 2026-04-02 21:29 by baoball
[考研] 324求调剂 +11 想上学求调 2026-04-02 11/550 2026-04-02 21:23 by 帕尔马拉特
[考研] 085602 找调剂 +3 逆时针快乐 2026-04-02 3/150 2026-04-02 21:23 by dongzh2009
[考研] 0856材料与化工调剂，339 +14 10213207 2026-03-31 14/700 2026-04-02 21:01 by 1104338198
[考研] 266分，一志愿电气工程，本科材料，求材料专业调剂 +7 哇呼哼呼哼 2026-04-02 7/350 2026-04-02 20:13 by yulian1987
[考研] 319求调剂 +16 太容易1018 2026-04-01 16/800 2026-04-02 20:12 by seattle40
[考研] 求调剂 +7 Aniyaio 2026-04-02 7/350 2026-04-02 16:42 by zzsw+
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +3 cs0106 2026-04-02 5/250 2026-04-02 11:37 by olim
[考研] 271求调剂 +15 勒布朗@ 2026-03-31 20/1000 2026-04-02 11:24 by Sammy2
[考研] 化学工程专硕324分，一志愿中国矿业大学求调剂 +7 耿耿1314 2026-04-01 7/350 2026-04-02 07:40 by 尚水阁主
[考研] 291求调剂 +20 Y-cap 2026-03-29 25/1250 2026-04-01 23:49 by 欣喜777
[考研] 085601材料工程找调剂 +20 oatmealR 2026-03-29 21/1050 2026-04-01 21:00 by lijunpoly
[考研] 080500-315分复试调剂 +9 上岸3821 2026-03-31 9/450 2026-03-31 17:29 by 唐沐儿
[考研] 抱歉 +3 田洪有 2026-03-30 3/150 2026-03-30 19:11 by 迷糊CCPs
[考研] 303求调剂 +7 DLkz1314. 2026-03-30 7/350 2026-03-30 16:05 by shuang5186
[考研] 一志愿中南大学化学0703总分337求调剂 +6 niko- 2026-03-27 6/300 2026-03-30 10:25 by herarysara
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +8 邱gl 2026-03-27 8/400 2026-03-28 12:42 by 唐沐儿
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭