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无心之感

金虫 (正式写手)

紫霄洞洞主

应助: 5 (幼儿园)
金币: 1593.6
散金: 164
红花: 4
帖子: 787
在线: 177小时
虫号: 1224839
注册: 2011-03-07
性别: GG
专业: 植物生理与生化

[求助] 分子clone之小白求助篇已有2人参与

本菜鸟最近遇到个顽固的作死cloning，硬生生死活连不上呐。你到底要闹哪样。

此处省略吐槽字样一千。。

进入正题：

问题描述：准备构建一个某蛋白定位载体，准备连接的片段有两个：该基因自身的Promoter（长约2K），Genomic（长约3K）测序都没问题；载体是pCAMBIA1301附带有EGFP序列（常用的植物表达载体）。双酶切回收后，使用T4 liagse（TaKaRa公司的）。反应体系如下：

T4 liagse....................... 2 ul
Promote片段................10ul
Genomic 片段................10ul
pCAMBIA 1301.............. 4ul
T4 buffer...................... 3ul
反应温度: 常温；反应时间：4h，然后转化。

但是。。问题来了。为嘛它就是连不上捏。。片段双酶切回收没有问题，酶切后1301空载也不长，说明载体已经切开了。难道是T4酶的问题？别的我也想不到了。
欢迎来和我讨论帮忙解决问题！欢迎提供新的方法（如此最好）！但凡有益，即发赏赐～