应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 分子clone之小白求助篇
31/1返回列表
查看: 693  |  回复: 2
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

无心之感

金虫 (正式写手)

紫霄洞洞主

[求助] 分子clone之小白求助篇 已有2人参与

本菜鸟最近遇到个顽固的作死cloning，硬生生死活连不上呐。你到底要闹哪样。此处省略吐槽字样一千。。

进入正题：

问题描述：准备构建一个某蛋白定位载体，准备连接的片段有两个：该基因自身的Promoter（长约2K），Genomic（长约3K）测序都没问题；载体是pCAMBIA1301附带有EGFP序列（常用的植物表达载体）。双酶切回收后，使用T4 liagse（TaKaRa公司的）。反应体系如下：

T4 liagse....................... 2 ul
Promote片段................10ul
Genomic 片段................10ul
pCAMBIA 1301.............. 4ul
T4 buffer...................... 3ul
反应温度: 常温； 反应时间：4h， 然后转化。

但是。。 问题来了。为嘛它就是连不上捏。。 片段双酶切回收没有问题，酶切后1301空载也不长，说明载体已经切开了。难道是T4酶的问题？ 别的我也想不到了。
欢迎来和我讨论帮忙解决问题！欢迎提供新的方法（如此最好）！但凡有益，即发赏赐～
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
天下风云出我辈，一入江湖岁月催，皇图霸业谈笑中，不胜人生一场醉！
1楼 2015-08-26 11:40:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无心之感: 金币+5, ★有帮助, 值得借鉴的方法 2015-08-26 13:47:25
首先看看有没有拿错盘了 有时糊涂了抗生素用错

然后这种三个片段连的，一般比两个片段连的困难一点

我们实验室一般会先把两个短的室温连个2-3小时，然后把最长的加进去（一般是载体）4度连一晚上

还有可以做个T4的阳性对照，确保你的酶没有问题

在或者换个菌株试试？祝你成功
赞一下 回复此楼
2楼2015-08-26 11:48:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

string1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
无心之感: 金币+1, ★有帮助, 赏你一个金币，为嘛不能发0.5个呢 2015-08-26 13:46:56
实在不行就一个一个来呗，同时连就是效率低。最好16度过夜。
赞一下 回复此楼
现在的志向是一个文艺技术男，远大的志向是一个气质理论教授
3楼2015-08-26 12:47:19
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 无心之感 的主题更新
31/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 265分求调剂不调专业和学校有行学上就 +6 礼堂丁真258 2026-02-28 9/450 2026-03-02 12:04 by 52hz~~
[考研] 284求调剂 +10 天下熯 2026-02-28 11/550 2026-03-02 11:03 by 无际的草原
[考研] 材料学硕318求调剂 +7 February_Feb 2026-03-01 7/350 2026-03-02 10:57 by 无际的草原
[考研] 264求调剂 +4 巴拉巴拉根556 2026-02-28 4/200 2026-03-02 10:48 by yuchj
[考研] 275求调剂 +3 L-xin? 2026-03-01 6/300 2026-03-02 10:22 by 热情沙漠
[考研] 调剂 +3 13853210211 2026-03-02 4/200 2026-03-02 10:16 by 13853210211
[考研] 282求调剂 +3 2103240126 2026-03-02 4/200 2026-03-02 09:25 by 汪！？！
[考研] 322求调剂 +3 熊境喆 2026-03-01 3/150 2026-03-02 08:44 by houyaoxu
[考研] 高分子化学与物理调剂 +6 好好好1233 2026-02-28 13/650 2026-03-02 07:27 by 好好好1233
[考研] 0857调剂 +4 一ll半 2026-02-28 5/250 2026-03-02 02:33 by 908055542
[考研] 279求调剂 +3 dua1 2026-03-01 4/200 2026-03-02 00:23 by 大脸蛋子
[考研] 275求调剂 +3 明远求学 2026-03-01 3/150 2026-03-01 22:29 by 刘兵
[考研] 26考研报考西工大材料308分求调剂 +3 weizhong123 2026-03-01 3/150 2026-03-01 21:42 by 公瑾逍遥
[考研] 272求调剂 +6 田智友 2026-02-28 6/300 2026-03-01 21:40 by 公瑾逍遥
[考研] 0856材料求调剂 +11 hyf hyf hyf 2026-02-28 12/600 2026-03-01 18:57 by 18137688336
[考研] 328求调剂 +3 aaadim 2026-03-01 5/250 2026-03-01 17:29 by njzyff
[考研] 285求调剂 +8 满头大汗的学生 2026-02-28 8/400 2026-03-01 16:47 by caszguilin
[基金申请] 刚录用，没有期刊号，但是在线可看的论文可以放为代表作吗 10+3 arang1 2026-03-01 3/150 2026-03-01 16:43 by babero
[论文投稿] Optics letters投稿被拒求助 30+3 luckyry 2026-02-26 4/200 2026-03-01 09:06 by babero
[考研] 307求调剂 +4 73372112 2026-02-28 6/300 2026-03-01 00:04 by ll247
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭