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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 分子clone之小白求助篇
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无心之感

金虫 (正式写手)

紫霄洞洞主

[求助] 分子clone之小白求助篇 已有2人参与

本菜鸟最近遇到个顽固的作死cloning，硬生生死活连不上呐。你到底要闹哪样。此处省略吐槽字样一千。。

进入正题：

问题描述：准备构建一个某蛋白定位载体，准备连接的片段有两个：该基因自身的Promoter（长约2K），Genomic（长约3K）测序都没问题；载体是pCAMBIA1301附带有EGFP序列（常用的植物表达载体）。双酶切回收后，使用T4 liagse（TaKaRa公司的）。反应体系如下：

T4 liagse....................... 2 ul
Promote片段................10ul
Genomic 片段................10ul
pCAMBIA 1301.............. 4ul
T4 buffer...................... 3ul
反应温度: 常温； 反应时间：4h， 然后转化。

但是。。 问题来了。为嘛它就是连不上捏。。 片段双酶切回收没有问题，酶切后1301空载也不长，说明载体已经切开了。难道是T4酶的问题？ 别的我也想不到了。
欢迎来和我讨论帮忙解决问题！欢迎提供新的方法（如此最好）！但凡有益，即发赏赐～
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天下风云出我辈，一入江湖岁月催，皇图霸业谈笑中，不胜人生一场醉！
1楼 2015-08-26 11:40:51
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
无心之感: 金币+5, ★有帮助, 值得借鉴的方法 2015-08-26 13:47:25
首先看看有没有拿错盘了 有时糊涂了抗生素用错

然后这种三个片段连的，一般比两个片段连的困难一点

我们实验室一般会先把两个短的室温连个2-3小时，然后把最长的加进去（一般是载体）4度连一晚上

还有可以做个T4的阳性对照，确保你的酶没有问题

在或者换个菌株试试？祝你成功
赞一下 回复此楼
2楼2015-08-26 11:48:36
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string1987

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
无心之感: 金币+1, ★有帮助, 赏你一个金币，为嘛不能发0.5个呢 2015-08-26 13:46:56
实在不行就一个一个来呗，同时连就是效率低。最好16度过夜。
赞一下 回复此楼
现在的志向是一个文艺技术男，远大的志向是一个气质理论教授
3楼2015-08-26 12:47:19
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