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一个CDS区大小为4000bp的基因，想构载体，可是设计好了引物从ATG开始到TGA 结束，怎么也跑不出来，这个基因有7种剪接体，一个都跑不出来，有什么好的解决方法吗 |
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jiashuhua292楼2015-08-26 11:11:01
3楼2015-08-26 11:20:15
evangelina
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jiashuhua29: 金币+20 2015-08-28 09:58:48
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jiashuhua29: 金币+20 2015-08-28 09:58:48
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你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做 例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来 然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体 4k的基因如果直接克隆，如果是从cDNA会有的困难的 除非你用比较高级的逆转录酶和高保真酶 如果有钱的话，直接叫公司给你合成吧 又或者如果是很普遍的基因，直接从addgene之类的公司买，很便宜的 |
4楼2015-08-26 11:25:49
5楼2015-08-26 11:33:34
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6楼2015-08-26 13:34:55
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7楼2015-08-26 13:35:56
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8楼2015-08-26 13:53:36
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9楼2015-08-26 16:01:28