应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
91/1返回列表
查看: 890  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jiashuhua29

铜虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有4人参与

一个CDS区大小为4000bp的基因，想构载体，可是设计好了引物从ATG开始到TGA 结束，怎么也跑不出来，这个基因有7种剪接体，一个都跑不出来，有什么好的解决方法吗
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-08-26 11:01:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那要看看你是怎么做的才能帮你找原因啊

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

jiashuhua29
2楼2015-08-26 11:11:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiashuhua29

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-08-26 11:11:01
那要看看你是怎么做的才能帮你找原因啊

你好，首先谢谢你的回复，我就是不想分段扩增，用了各种酶，pfu,LA,primeSTARTM HS等，程序都是严格按照说明书来做的，跑出来的条带一般都在1500bp左右，没有目的条带，我又按照网上说的先设一对引物在CDS外也就是UTR区，然后把跑出来的pcr产物稀释100倍，再用第二对引物也就是扩CDS区的引物来扩增，还是没有目的条带。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2015-08-26 11:20:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:07
jiashuhua29: 金币+20 2015-08-28 09:58:48
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基因如果直接克隆，如果是从cDNA会有的困难的
除非你用比较高级的逆转录酶和高保真酶

如果有钱的话，直接叫公司给你合成吧
又或者如果是很普遍的基因，直接从addgene之类的公司买，很便宜的
赞一下 回复此楼
4楼2015-08-26 11:25:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiashuhua29

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:25:49
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基 ...

谢谢，我的基因比较新，可能还是得靠自己做，我也试过分成两段，但是发现2000左右没有比较好的引物，设了一对结果也没跑出来，而且分成两段从ATG开始的那个引物和到TGA 的那个引物还是得用上，但是这两个引物本来就不是很好，我就怕分成两段也跑不出来。
赞一下 回复此楼
5楼2015-08-26 11:33:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:25:49
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基 ...

这和烧钱有什么区别，4k的片段，怎么着也得1w2吧，够做好多事了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-08-26 13:34:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

RNA质量要好，引物OK了，一般都能扩出来的

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-08-26 13:35:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:25
分段PCR，再重叠PCR。多分几段也没问题，引物扩增条件相近的话，不增加多少工作。合成基因也就是分500bp左右一段接好，再重叠PCR或同源重组。
赞一下 回复此楼
8楼2015-08-26 13:53:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:38
用KOD-FX试试，另外，可以分成两段，之间有20-40bp的overlap，然后直接一步同源重组到你要的载体里去。
赞一下 回复此楼
9楼2015-08-26 16:01:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jiashuhua29 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿哈尔滨工业大学085600英一数二337分求调剂 +5 lyz0427 2026-04-03 5/250 2026-04-04 06:10 by xuxiang
[考研] 268求调剂 +8 你好tg 2026-04-03 9/450 2026-04-04 05:08 by gswylq
[考研] 化学308分调剂 +21 你好明天你好 2026-03-30 22/1100 2026-04-03 21:32 by 百灵童888
[考研] 学硕288调剂!!! +3 小王xw123 2026-04-03 3/150 2026-04-03 21:20 by 啵啵啵0119
[考研] 283分求调剂 +6 小聂爱学习 2026-04-03 6/300 2026-04-03 20:46 by zhq0425
[考研] 286求调剂 +8 lim0922 2026-04-02 8/400 2026-04-03 20:19 by rzh123456
[考研] 327求调剂 +9 小卡不卡. 2026-03-29 9/450 2026-04-03 19:48 by 百灵童888
[考研] 考研调剂 +8 不爱喝饮料 2026-04-03 8/400 2026-04-03 16:40 by Mistake-J
[考研] 求调剂不挑专业 +3 xrh030412 2026-04-01 3/150 2026-04-03 14:40 by 氮气气气
[考研] 285求调剂 +7 AZMK 2026-04-02 9/450 2026-04-03 11:12 by wanwan00
[考研] 295求调剂 +7 愿旅途永远坦然 2026-04-02 7/350 2026-04-03 08:22 by fangshan711
[考研] 求调剂 +7 Aniyaio 2026-04-02 7/350 2026-04-02 16:42 by zzsw+
[考研] 26考研调剂 +4 Wnz.20030617 2026-04-01 5/250 2026-04-02 16:11 by 1939136013狗壮
[考研] 282求调剂 +13 呼吸都是减肥 2026-04-01 13/650 2026-04-02 14:10 by baoball
[考研] 食品学硕362求调剂 +3 xuanxianxian 2026-04-01 3/150 2026-04-01 21:05 by 啊李999
[考研] 353求调剂 +4 拉钩不许变 2026-04-01 4/200 2026-04-01 18:10 by 记事本2026
[考研] 材料调剂 +10 Eujd1 2026-03-31 11/550 2026-04-01 11:23 by ivanqyq
[考研] 本2一志愿C9-333分，材料科学与工程，求调剂 +9 升升不降 2026-03-31 9/450 2026-03-31 18:01 by 无际的草原
[考研] 调剂求院校招收 +7 鹤鲸鸽 2026-03-28 7/350 2026-03-31 11:21 by oooqiao
[考研] 356求调剂 +3 gysy?s?a 2026-03-28 3/150 2026-03-29 00:33 by 544594351
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭