应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建
91/1返回列表
查看: 1126  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jiashuhua29

铜虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有4人参与

一个CDS区大小为4000bp的基因，想构载体，可是设计好了引物从ATG开始到TGA 结束，怎么也跑不出来，这个基因有7种剪接体，一个都跑不出来，有什么好的解决方法吗
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2015-08-26 11:01:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那要看看你是怎么做的才能帮你找原因啊

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

jiashuhua29
2楼2015-08-26 11:11:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiashuhua29

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-08-26 11:11:01
那要看看你是怎么做的才能帮你找原因啊

你好，首先谢谢你的回复，我就是不想分段扩增，用了各种酶，pfu,LA,primeSTARTM HS等，程序都是严格按照说明书来做的，跑出来的条带一般都在1500bp左右，没有目的条带，我又按照网上说的先设一对引物在CDS外也就是UTR区，然后把跑出来的pcr产物稀释100倍，再用第二对引物也就是扩CDS区的引物来扩增，还是没有目的条带。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2015-08-26 11:20:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:07
jiashuhua29: 金币+20 2015-08-28 09:58:48
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基因如果直接克隆，如果是从cDNA会有的困难的
除非你用比较高级的逆转录酶和高保真酶

如果有钱的话，直接叫公司给你合成吧
又或者如果是很普遍的基因，直接从addgene之类的公司买，很便宜的
赞一下 回复此楼
4楼2015-08-26 11:25:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jiashuhua29

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:25:49
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基 ...

谢谢，我的基因比较新，可能还是得靠自己做，我也试过分成两段，但是发现2000左右没有比较好的引物，设了一对结果也没跑出来，而且分成两段从ATG开始的那个引物和到TGA 的那个引物还是得用上，但是这两个引物本来就不是很好，我就怕分成两段也跑不出来。
赞一下 回复此楼
5楼2015-08-26 11:33:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:25:49
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基 ...

这和烧钱有什么区别，4k的片段，怎么着也得1w2吧，够做好多事了

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2015-08-26 13:34:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

RNA质量要好，引物OK了，一般都能扩出来的

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
7楼2015-08-26 13:35:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:25
分段PCR，再重叠PCR。多分几段也没问题，引物扩增条件相近的话，不增加多少工作。合成基因也就是分500bp左右一段接好，再重叠PCR或同源重组。
赞一下 回复此楼
8楼2015-08-26 13:53:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:38
用KOD-FX试试，另外，可以分成两段，之间有20-40bp的overlap，然后直接一步同源重组到你要的载体里去。
赞一下 回复此楼
9楼2015-08-26 16:01:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jiashuhua29 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-16 17:12 by i3KBRD19ERkG
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 5/250 2026-09-16 15:51 by i3KBRD19ERkG
[考博] 上海工程技术大学激光智能制造课题组｜2027级博士研究生招生公告 +7 水士口 2026-09-16 8/400 2026-09-16 13:47 by kkklens
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 Aj1rhIDL5ixY 2026-09-14 4/200 2026-09-16 07:48 by i0IGWqQuchto
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +4 40ms4Wlo4umh 2026-09-14 4/200 2026-09-16 06:27 by LH5NkK5Ud4bh
[考研] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 23jxep3nCNZb 2026-09-14 3/150 2026-09-16 06:11 by LH5NkK5Ud4bh
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-16 05:27 by LH5NkK5Ud4bh
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 5/250 2026-09-16 04:51 by LH5NkK5Ud4bh
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 4/200 2026-09-16 04:27 by DgNGHc3h5tPl
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +7 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 7/350 2026-09-16 02:35 by DgNGHc3h5tPl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +7 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 8/400 2026-09-16 02:23 by DgNGHc3h5tPl
[考博] 申博发邮件 +4 Lmengk 2026-09-15 4/200 2026-09-16 00:05 by 木心想继续深造
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 5/250 2026-09-15 16:39 by CgyNCDVNhGVg
[硕博家园] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 5/250 2026-09-15 15:14 by CgyNCDVNhGVg
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 5/250 2026-09-15 14:58 by CgyNCDVNhGVg
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +6 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 7/350 2026-09-15 14:22 by VMDqgnlKimtZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-15 08:14 by C79jjtjAKjEn
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 6/300 2026-09-15 05:50 by 5BDX0d0WFp7t
[考博] 27秋季材料博士申请求助 10+3 Cahal1 2026-09-11 4/200 2026-09-14 08:50 by 北京莱茵编辑
[教师之家] 浙江师范大学是怎么坑我的 +10 recruit123 2026-09-09 15/750 2026-09-13 10:45 by seaskyy
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭