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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 载体构建
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jiashuhua29

铜虫 (小有名气)

[求助] 载体构建 已有4人参与

一个CDS区大小为4000bp的基因，想构载体，可是设计好了引物从ATG开始到TGA 结束，怎么也跑不出来，这个基因有7种剪接体，一个都跑不出来，有什么好的解决方法吗
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1楼 2015-08-26 11:01:52
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
那要看看你是怎么做的才能帮你找原因啊

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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

jiashuhua29
2楼2015-08-26 11:11:01
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jiashuhua29

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-08-26 11:11:01
那要看看你是怎么做的才能帮你找原因啊

你好，首先谢谢你的回复，我就是不想分段扩增，用了各种酶，pfu,LA,primeSTARTM HS等，程序都是严格按照说明书来做的，跑出来的条带一般都在1500bp左右，没有目的条带，我又按照网上说的先设一对引物在CDS外也就是UTR区，然后把跑出来的pcr产物稀释100倍，再用第二对引物也就是扩CDS区的引物来扩增，还是没有目的条带。
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3楼2015-08-26 11:20:15
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evangelina

无虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:07
jiashuhua29: 金币+20 2015-08-28 09:58:48
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基因如果直接克隆，如果是从cDNA会有的困难的
除非你用比较高级的逆转录酶和高保真酶

如果有钱的话，直接叫公司给你合成吧
又或者如果是很普遍的基因，直接从addgene之类的公司买，很便宜的
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4楼2015-08-26 11:25:49
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jiashuhua29

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:25:49
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基 ...

谢谢，我的基因比较新，可能还是得靠自己做，我也试过分成两段，但是发现2000左右没有比较好的引物，设了一对结果也没跑出来，而且分成两段从ATG开始的那个引物和到TGA 的那个引物还是得用上，但是这两个引物本来就不是很好，我就怕分成两段也跑不出来。
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5楼2015-08-26 11:33:34
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by evangelina at 2015-08-26 11:25:49
你可以试试把它拆分成两个片段，用overlapping PCR去做
例如说分成两个2k的片段，一般就比较好做PCR，先克隆到T载体，测序，如有变异先把它变回来
然后就用头尾的引物做PCR，再把全长片段克隆到目标载体

4k的基 ...

这和烧钱有什么区别，4k的片段，怎么着也得1w2吧，够做好多事了

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6楼2015-08-26 13:34:55
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

RNA质量要好，引物OK了，一般都能扩出来的

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7楼2015-08-26 13:35:56
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AnaSequence

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:25
分段PCR，再重叠PCR。多分几段也没问题，引物扩增条件相近的话，不增加多少工作。合成基因也就是分500bp左右一段接好，再重叠PCR或同源重组。
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8楼2015-08-26 13:53:36
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-08-26 23:06:38
用KOD-FX试试，另外，可以分成两段，之间有20-40bp的overlap，然后直接一步同源重组到你要的载体里去。
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9楼2015-08-26 16:01:28
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