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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 提质粒跑胶
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新的自我100

金虫 (初入文坛)

[求助] 提质粒跑胶 已有4人参与

提出的质粒跑胶结果要怎么分析，要怎么和Marker比较来判断是否其是否正确？谢谢！
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1楼 2015-08-25 22:59:34
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
环状DNA跑电泳也可以看大小，和线状的迁移率没差那么大，根据marker的大小，也就是看个大概，想要确切认证是否正确插入片段，只能测序
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6楼2015-08-26 10:32:49
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ksws0465326

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
新的自我100: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-08-26 14:57:54
引用回帖:
7楼: Originally posted by 新的自我100 at 2015-08-26 10:35:32
但环状的跑出的条带大小并不正确，所以质粒跑胶结果只是看够不够亮，浓度够不够，这样理解对吗？...

一般情况下，我常做的时候是，忽略环状和线状DNA迁移率的差异，即环状DNA的大小即为线状DNA的大小，所以电泳时的大小即可认为是正确的。但是验证重组质粒时，用电泳跑完整的质粒，以及用特异性引物p出的条带，以及使用单酶切，双酶切等的产物进行电泳验证时，都是主观判断条带大小，无法100%确认是否正确，比如，你插入的目的片段为1K，但是由于某种未知原因重组时有可能会缺失或增加几bp或10几bp（我只说是可能性，并不一定真的是这几个碱基大小）。这种情况下，你跑普通电泳的话基本是判断不出来两者之间的差别的，所以想要100%确认重组质粒是否正确，电泳初步判断后还是要进行测序验证后，才能进行下面的实验的。
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10楼2015-08-26 12:47:51
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普通回帖

Huobol

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
新的自我100: 金币+1, ★有帮助 2015-08-26 14:58:45
插入目的片段后的重组质粒的大小是可以算的，比如2692 bp的pMD19-T载体，其重组质粒大小就等于2692加插入的目的片段的大小，这样质粒电泳后参照Marker就知道重组质粒条带的大致位置了。最后还是要测序验证。

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让羽毛再飞一会儿
2楼2015-08-26 01:52:35
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新的自我100

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Huobol at 2015-08-26 01:52:35
插入目的片段后的重组质粒的大小是可以算的，比如2692 bp的pMD19-T载体，其重组质粒大小就等于2692加插入的目的片段的大小，这样质粒电泳后参照Marker就知道重组质粒条带的大致位置了。最后还是要测序验证。
...

但提出的质粒不是环状吗？大小不能那么看吧？
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3楼2015-08-26 09:24:07
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
新的自我100: 金币+1, ★有帮助 2015-08-26 14:59:00
引用回帖:
3楼: Originally posted by 新的自我100 at 2015-08-26 09:24:07
但提出的质粒不是环状吗？大小不能那么看吧？...

加入限制性内切酶酶切后，不就是线性了，这样跑胶不就可以比对了
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4楼2015-08-26 09:36:08
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新的自我100

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-08-26 09:36:08
加入限制性内切酶酶切后，不就是线性了，这样跑胶不就可以比对了...

恩，好的，谢谢，但如果不进行酶切验证，只是提的质粒进行跑胶的话，那个只是看是否有提出而不能看他的大小是吗？
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5楼2015-08-26 10:23:31
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新的自我100

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ksws0465326 at 2015-08-26 10:32:49
环状DNA跑电泳也可以看大小，和线状的迁移率没差那么大，根据marker的大小，也就是看个大概，想要确切认证是否正确插入片段，只能测序

但环状的跑出的条带大小并不正确，所以质粒跑胶结果只是看够不够亮，浓度够不够，这样理解对吗？
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7楼2015-08-26 10:35:32
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duanh19

捐助贵宾 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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环状质粒电泳会与Maker有一定的差别的。下面是我最近做真核表达时候跑pPICZαA质粒，仅供参考。希望可以多多交流！
提质粒跑胶
pp.jpg
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8楼2015-08-26 11:04:29
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新的自我100

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by duanh19 at 2015-08-26 11:04:29
环状质粒电泳会与Maker有一定的差别的。下面是我最近做真核表达时候跑pPICZαA质粒，仅供参考。希望可以多多交流！

pp.jpg

嗯嗯，好的谢谢
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9楼2015-08-26 11:28:11
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