应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白活性实验ELISA检测结果无法解释，求助。
91/1返回列表
查看: 2279  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

jusperchan

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白活性实验ELISA检测结果无法解释，求助。 已有2人参与

实验目的：检测某蛋白可以刺激肝细胞内cAMP量上升。
实验过程：
1我们没有正常的肝细胞，于是就拿了HepG2细胞代替肝细胞（我们参考的文献也是用的HepG2）。
2实验具体流程是：培养HepG2，消化
用加血清的培养基稀释到1.5*10^5每毫升；
96孔板中每孔加200ul稀释细胞液，37度培养5h；
吸掉培养液，换成200ul不含血清的培养基，培养24h；
（这个时候观察，基本96孔底部已经被铺满了）
去掉培养基，换成170ul培养基，加10ulIBMX（抑制水解cAMP的酶，从而使cAMP在细胞内累积），加入20ul蛋白样品，另设置溶解蛋白buffer对照组（buffer成分为磷酸盐缓冲液和低浓度氯化钠）。
培养1h，去掉培养基，换成0.1mol盐酸裂解细胞30min，收取上清。
（至此，样品就做好了，接下来的elisa操作全部按照试剂盒要求做的，唯一不同的是，我们怕加盐酸导致pH太低，在样品中加入了磷酸氢二钠中和pH到7左右）
3实验结果：做了好几次，每次buffer对照组的吸光度都比浓度最高的实验组的吸光度高，而且梯度的实验组很难看出趋势。我们的想法是，即使蛋白没有效果，那测的cAMP的量至少应该和仅有buffer的效果一样啊，不会有明显差异的才对。
因为我们在这方面不是专业的，具体方法也是网上找的，请问到底哪一步出现了问题才会有这种结果？（如果实验细节不详细，可以问，我再具体说哈）

[ Last edited by jusperchan on 2015-8-14 at 11:20 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2015-08-13 17:37:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Wuyou115

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你们设计了实验组和阴性对照组（buffer）， 请问有阳性对照组吗？就是用已经报道过可以明显刺激肝细胞内cAMP量上升的物质处理细胞的对照组。。。因为加这个可以确认你们的system有没有没问题。。。
赞一下 回复此楼
2楼2015-08-14 15:04:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
阳性对照最好做上，根据你的描述，阴性对照都比实验组的吸光度高，那应该是你elisa的原因（你的操作或试剂盒原因）
赞一下 回复此楼
3楼2015-08-14 15:41:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Wuyou115 at 2015-08-14 15:04:40
你们设计了实验组和阴性对照组（buffer）， 请问有阳性对照组吗？就是用已经报道过可以明显刺激肝细胞内cAMP量上升的物质处理细胞的对照组。。。因为加这个可以确认你们的system有没有没问题。。。

是这样的，阳性对照品要花钱买，太贵了额。。所以我们就想在没阳性对照的情况下做，结果实验数据乱七八糟，完全没有分析价值啊。
赞一下 回复此楼
4楼2015-08-18 13:52:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-14 15:41:27
阳性对照最好做上，根据你的描述，阴性对照都比实验组的吸光度高，那应该是你elisa的原因（你的操作或试剂盒原因）

ELISA的问题主要出在哪里呢？我们没专门做过elisa实验。按照他的操作手册上来的，我们没用排枪，都是依次加的，会不会有时间差的问题？还有，显色剂我们是现用现配，配好就用的，避光加有点困难，我们都是正常加进去，然后用锡箔纸抱起来放37里，15min终止，会不会太长了或者曝光了？
赞一下 回复此楼
5楼2015-08-18 13:55:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jusperchan at 2015-08-18 13:55:33
ELISA的问题主要出在哪里呢？我们没专门做过elisa实验。按照他的操作手册上来的，我们没用排枪，都是依次加的，会不会有时间差的问题？还有，显色剂我们是现用现配，配好就用的，避光加有点困难，我们都是正常加进 ...

你所说的问题应该不是主要问题 你们没有排枪 那你们洗涤的时候岂不很麻烦？你们洗几遍？如果洗不干净，阴性也会显色的
赞一下 回复此楼
6楼2015-08-18 14:26:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-18 14:26:58
你所说的问题应该不是主要问题 你们没有排枪 那你们洗涤的时候岂不很麻烦？你们洗几遍？如果洗不干净，阴性也会显色的...

cAMP细胞本身也有产生，而且我们加了抑制cAMP水解的物质，所以显色我觉得是正常的，关键是，我们的实验组数据异常，比阴性还低，这是头疼的地方。而且数值都挺高的，吸光度大部分都在0.5-0.8之间。
蛋白没活性，总不会还起反作用，导致细胞内cAMP量下降吧？
赞一下 回复此楼
7楼2015-08-18 17:03:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

青蛙良

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jusperchan at 2015-08-18 17:03:54
cAMP细胞本身也有产生，而且我们加了抑制cAMP水解的物质，所以显色我觉得是正常的，关键是，我们的实验组数据异常，比阴性还低，这是头疼的地方。而且数值都挺高的，吸光度大部分都在0.5-0.8之间。
蛋白没活性，总 ...

楼主问题解决了吗？我也遇到了这方面的问题，空白对照组比实验组还高！！求交流啊！！1
赞一下(1人) 回复此楼
乐观、自信、爱
8楼2015-10-18 16:07:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 青蛙良 at 2015-10-18 16:07:05
楼主问题解决了吗？我也遇到了这方面的问题，空白对照组比实验组还高！！求交流啊！！1...

好久没登录了。。。后来证明了，我们用的国产试剂盒不行，买进口的，数据完美的很。
赞一下 回复此楼
9楼2017-03-16 16:08:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 jusperchan 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 6/300 2026-08-29 11:51 by jCd0dEvKHShX
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 11:18 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +3 349506619 2026-08-28 3/150 2026-08-29 10:49 by 木风9012
[教师之家] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 7/350 2026-08-29 09:26 by G6APbkg8SA6w
[博后之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 4/200 2026-08-29 05:45 by gy1nBQXYQJqL
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +9 炎黄贵胄 2026-08-22 10/500 2026-08-26 15:40 by semaglutide
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 明天应该可查了！？ +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭