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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白活性实验ELISA检测结果无法解释，求助。
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jusperchan

银虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白活性实验ELISA检测结果无法解释，求助。 已有2人参与

实验目的：检测某蛋白可以刺激肝细胞内cAMP量上升。
实验过程：
1我们没有正常的肝细胞，于是就拿了HepG2细胞代替肝细胞（我们参考的文献也是用的HepG2）。
2实验具体流程是：培养HepG2，消化
用加血清的培养基稀释到1.5*10^5每毫升；
96孔板中每孔加200ul稀释细胞液，37度培养5h；
吸掉培养液，换成200ul不含血清的培养基，培养24h；
（这个时候观察，基本96孔底部已经被铺满了）
去掉培养基，换成170ul培养基，加10ulIBMX（抑制水解cAMP的酶，从而使cAMP在细胞内累积），加入20ul蛋白样品，另设置溶解蛋白buffer对照组（buffer成分为磷酸盐缓冲液和低浓度氯化钠）。
培养1h，去掉培养基，换成0.1mol盐酸裂解细胞30min，收取上清。
（至此，样品就做好了，接下来的elisa操作全部按照试剂盒要求做的，唯一不同的是，我们怕加盐酸导致pH太低，在样品中加入了磷酸氢二钠中和pH到7左右）
3实验结果：做了好几次，每次buffer对照组的吸光度都比浓度最高的实验组的吸光度高，而且梯度的实验组很难看出趋势。我们的想法是，即使蛋白没有效果，那测的cAMP的量至少应该和仅有buffer的效果一样啊，不会有明显差异的才对。
因为我们在这方面不是专业的，具体方法也是网上找的，请问到底哪一步出现了问题才会有这种结果？（如果实验细节不详细，可以问，我再具体说哈）

[ Last edited by jusperchan on 2015-8-14 at 11:20 ]
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1楼 2015-08-13 17:37:38
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Wuyou115

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你们设计了实验组和阴性对照组（buffer）， 请问有阳性对照组吗？就是用已经报道过可以明显刺激肝细胞内cAMP量上升的物质处理细胞的对照组。。。因为加这个可以确认你们的system有没有没问题。。。
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2楼2015-08-14 15:04:40
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
阳性对照最好做上，根据你的描述，阴性对照都比实验组的吸光度高，那应该是你elisa的原因（你的操作或试剂盒原因）
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3楼2015-08-14 15:41:27
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jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Wuyou115 at 2015-08-14 15:04:40
你们设计了实验组和阴性对照组（buffer）， 请问有阳性对照组吗？就是用已经报道过可以明显刺激肝细胞内cAMP量上升的物质处理细胞的对照组。。。因为加这个可以确认你们的system有没有没问题。。。

是这样的，阳性对照品要花钱买，太贵了额。。所以我们就想在没阳性对照的情况下做，结果实验数据乱七八糟，完全没有分析价值啊。
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4楼2015-08-18 13:52:54
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jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-14 15:41:27
阳性对照最好做上，根据你的描述，阴性对照都比实验组的吸光度高，那应该是你elisa的原因（你的操作或试剂盒原因）

ELISA的问题主要出在哪里呢？我们没专门做过elisa实验。按照他的操作手册上来的，我们没用排枪，都是依次加的，会不会有时间差的问题？还有，显色剂我们是现用现配，配好就用的，避光加有点困难，我们都是正常加进去，然后用锡箔纸抱起来放37里，15min终止，会不会太长了或者曝光了？
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5楼2015-08-18 13:55:33
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673643401

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by jusperchan at 2015-08-18 13:55:33
ELISA的问题主要出在哪里呢？我们没专门做过elisa实验。按照他的操作手册上来的，我们没用排枪，都是依次加的，会不会有时间差的问题？还有，显色剂我们是现用现配，配好就用的，避光加有点困难，我们都是正常加进 ...

你所说的问题应该不是主要问题 你们没有排枪 那你们洗涤的时候岂不很麻烦？你们洗几遍？如果洗不干净，阴性也会显色的
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6楼2015-08-18 14:26:58
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jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 673643401 at 2015-08-18 14:26:58
你所说的问题应该不是主要问题 你们没有排枪 那你们洗涤的时候岂不很麻烦？你们洗几遍？如果洗不干净，阴性也会显色的...

cAMP细胞本身也有产生，而且我们加了抑制cAMP水解的物质，所以显色我觉得是正常的，关键是，我们的实验组数据异常，比阴性还低，这是头疼的地方。而且数值都挺高的，吸光度大部分都在0.5-0.8之间。
蛋白没活性，总不会还起反作用，导致细胞内cAMP量下降吧？
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7楼2015-08-18 17:03:54
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青蛙良

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by jusperchan at 2015-08-18 17:03:54
cAMP细胞本身也有产生，而且我们加了抑制cAMP水解的物质，所以显色我觉得是正常的，关键是，我们的实验组数据异常，比阴性还低，这是头疼的地方。而且数值都挺高的，吸光度大部分都在0.5-0.8之间。
蛋白没活性，总 ...

楼主问题解决了吗？我也遇到了这方面的问题，空白对照组比实验组还高！！求交流啊！！1
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乐观、自信、爱
8楼2015-10-18 16:07:05
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jusperchan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 青蛙良 at 2015-10-18 16:07:05
楼主问题解决了吗？我也遇到了这方面的问题，空白对照组比实验组还高！！求交流啊！！1...

好久没登录了。。。后来证明了，我们用的国产试剂盒不行，买进口的，数据完美的很。
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9楼2017-03-16 16:08:29
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