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蛋白活性实验ELISA检测结果无法解释，求助。 已有2人参与
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实验目的：检测某蛋白可以刺激肝细胞内cAMP量上升。 实验过程： 1我们没有正常的肝细胞，于是就拿了HepG2细胞代替肝细胞（我们参考的文献也是用的HepG2）。 2实验具体流程是：培养HepG2，消化 用加血清的培养基稀释到1.5*10^5每毫升； 96孔板中每孔加200ul稀释细胞液，37度培养5h； 吸掉培养液，换成200ul不含血清的培养基，培养24h； （这个时候观察，基本96孔底部已经被铺满了） 去掉培养基，换成170ul培养基，加10ulIBMX（抑制水解cAMP的酶，从而使cAMP在细胞内累积），加入20ul蛋白样品，另设置溶解蛋白buffer对照组（buffer成分为磷酸盐缓冲液和低浓度氯化钠）。 培养1h，去掉培养基，换成0.1mol盐酸裂解细胞30min，收取上清。 （至此，样品就做好了，接下来的elisa操作全部按照试剂盒要求做的，唯一不同的是，我们怕加盐酸导致pH太低，在样品中加入了磷酸氢二钠中和pH到7左右） 3实验结果：做了好几次，每次buffer对照组的吸光度都比浓度最高的实验组的吸光度高，而且梯度的实验组很难看出趋势。我们的想法是，即使蛋白没有效果，那测的cAMP的量至少应该和仅有buffer的效果一样啊，不会有明显差异的才对。 因为我们在这方面不是专业的，具体方法也是网上找的，请问到底哪一步出现了问题才会有这种结果？（如果实验细节不详细，可以问，我再具体说哈） [ Last edited by jusperchan on 2015-8-14 at 11:20 ] |
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