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顾钻研

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助,怎样才能做好细菌DGGE图 已有2人参与

本人正在做细菌DGGE,但是出来的图条带模糊一片,而且跑不开,细菌PCR扩增条带都是很亮的,我做的胶是20%-40%,90v电泳12h,染色20min,求助为什么跑出来的图如下面这样呢?请各位大神指点指点。。。。。。

求助,怎样才能做好细菌DGGE图
1.PNG


求助,怎样才能做好细菌DGGE图-1
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雨夜不爱学

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我最近也在做细菌dgge啊,摸索中,我感觉你的pcr条带有拖尾,可能是引物特异性不好,另外DGGE感觉你的胶的梯度太小,35%-65%常见,我用的是35—55%,为保证肉眼可见的确定胶的梯度,可以在高浓度胶中加入dye sloution 。配方的话在仪器的menu中都有。
4楼2015-08-19 10:08:28
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shanliwademen

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
顾钻研: 金币+3 2015-08-13 14:44:36
根据你的描述和从图上看,主要存在两个问题,一是胶不合适,主要是不同浓度变性剂的胶没有混成梯度,而是电泳条件不合适。所以建议如下,1,如果变性剂是用的尿素,请用30%和60%的胶,而且要事先用红蓝胶模拟配胶确保变性梯度均匀,2,请用,105伏电压10小时电泳。同时注意两个小问题,1,保证电泳液恒温,如果电泳4小时后电泳液温度上升太高会出现彗星泳道,2,微量上样器点样是不飘不穿无气泡。当然我以上所说是认为你pcr的DNA是没问题的,但看你的pcr结果我还是不放心,建议下次加对照。上述为鄙人拙见,如有不妥之处请批评指正。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2015-08-13 01:29:16
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顾钻研

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shanliwademen at 2015-08-13 01:29:16
根据你的描述和从图上看,主要存在两个问题,一是胶不合适,主要是不同浓度变性剂的胶没有混成梯度,而是电泳条件不合适。所以建议如下,1,如果变性剂是用的尿素,请用30%和60%的胶,而且要事先用红蓝胶模拟配胶确保 ...

我之前做过40%-60%的胶。110v电压10小时,出现的带也是模糊一片,我自己也认为是我做胶的问题,你说的红蓝胶模拟配胶是怎样做的,我们实验室没听说有人这样做过,所以我还不知道怎么做?还有我的PCR扩增,有哪里不好吗?我看不出来,指教一下?
3楼2015-08-13 14:44:28
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