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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母重组转化子pcr鉴定问题
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yyong2

新虫 (初入文坛)

[交流] 毕赤酵母重组转化子pcr鉴定问题 已有3人参与

各位同仁大侠好：
我最近在做给一个基因的C端加上标签以便于后期蛋白纯化研究其结构，采用的是pcr介导的同源重组。目标区域上下游各取51-54bp的同源序列作为pcr引物一部分，另加载体引物22bp，利用携带标签和筛选标记的质粒做模板进行pcr扩增，pcr产物测序正确，pcr产物纯化后电转化到毕赤酵母X33中，Zeocin筛选，30度培养3天后有转化子出现，摇菌、抽提酵母基因组DNA，以此为模板进行pcr，抗性基因有产物，但是跨插入区域的引物pcr结果显示此区域没有插入（即pcr产物是正常非插入大小），再选一个插入片段内的引物和目标区域的组合得不到pcr产物。从抗性筛选标记来说目的片段是整合到酵母基因组中的，但是整合位置似乎不在目标区域（因为pcr检测不到有插入），那能整合到基因组的什么位置呢？不解？？？求解，感谢！我只有一个金币全给啊
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1楼 2015-08-07 11:41:54
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杜小蕾

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不知道楼主现在做出来了吗？我目前也在做酵母同源重组，所遇到的问题跟你一模一样，请楼主指教
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2楼2017-02-23 15:41:51
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皮妮1123

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也在做电转X33，结果筛选后提基因组无条带，好伤心，做了2个月了都，请问你的问题解决了吗？
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3楼2017-06-17 10:55:03
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asdqwer1234

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好，我最近也遇到了同样的问题，可以交流一下吗

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4楼2018-11-14 20:53:58
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