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毕赤酵母重组转化子pcr鉴定问题 已有3人参与
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各位同仁大侠好： 我最近在做给一个基因的C端加上标签以便于后期蛋白纯化研究其结构，采用的是pcr介导的同源重组。目标区域上下游各取51-54bp的同源序列作为pcr引物一部分，另加载体引物22bp，利用携带标签和筛选标记的质粒做模板进行pcr扩增，pcr产物测序正确，pcr产物纯化后电转化到毕赤酵母X33中，Zeocin筛选，30度培养3天后有转化子出现，摇菌、抽提酵母基因组DNA，以此为模板进行pcr，抗性基因有产物，但是跨插入区域的引物pcr结果显示此区域没有插入（即pcr产物是正常非插入大小），再选一个插入片段内的引物和目标区域的组合得不到pcr产物。从抗性筛选标记来说目的片段是整合到酵母基因组中的，但是整合位置似乎不在目标区域（因为pcr检测不到有插入），那能整合到基因组的什么位置呢？不解？？？求解，感谢！我只有一个金币全给啊 |
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