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Ratiy

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR是成功的,但是漏P约30左右bp,这是为什么 已有2人参与

是这样的,我是要构建一个质粒,我设计的引物5‘端有酶切位点(已经加了保护碱基),我使用的是Tag酶进行PCR,经过PCR,胶回收,双酶切,胶回收,T4连接(与载体pcDNA3.1(+)连接),转化,挑单克隆,酶切鉴定,测序,最后发现我的目的基因的确与我想要的载体连接上了,但是发现缺失部分序列,求大神找出可能的原因~
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Ratiy

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-08-07 00:54:07
很可能是酶切时候产生新号活性,把pcr产物错切了一段。你可以看看少了的片段的末尾,是否和限制酶的识别位点比较相似。如果是的话,建议减少酶切时间和酶的用量,加大反应体系。

还有就是pcr产物里就有那个酶切位 ...

那么我只是酶切了3个小时多,不是要才不多16个小时才会出现星活性吗?
4楼2015-08-09 14:04:05
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
Ratiy: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-08-09 13:55:15
很可能是酶切时候产生新号活性,把pcr产物错切了一段。你可以看看少了的片段的末尾,是否和限制酶的识别位点比较相似。如果是的话,建议减少酶切时间和酶的用量,加大反应体系。

还有就是pcr产物里就有那个酶切位点。
初来乍到,请多指教
2楼2015-08-07 00:54:07
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼上说的有点道理,这么多资料,找找看吧
http://www.detaibio.com/material-downloads.html
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-08-07 09:35:05
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