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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR是成功的，但是漏P约30左右bp,这是为什么
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Ratiy

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR是成功的，但是漏P约30左右bp,这是为什么 已有2人参与

是这样的，我是要构建一个质粒，我设计的引物5‘端有酶切位点（已经加了保护碱基），我使用的是Tag酶进行PCR，经过PCR，胶回收，双酶切，胶回收，T4连接（与载体pcDNA3.1(+)连接），转化，挑单克隆，酶切鉴定，测序，最后发现我的目的基因的确与我想要的载体连接上了，但是发现缺失部分序列，求大神找出可能的原因~
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1楼 2015-08-06 22:56:22
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Ratiy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-08-07 00:54:07
很可能是酶切时候产生新号活性，把pcr产物错切了一段。你可以看看少了的片段的末尾，是否和限制酶的识别位点比较相似。如果是的话，建议减少酶切时间和酶的用量，加大反应体系。

还有就是pcr产物里就有那个酶切位 ...

那么我只是酶切了3个小时多，不是要才不多16个小时才会出现星活性吗？
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4楼2015-08-09 14:04:05
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Ratiy: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-08-09 13:55:15
很可能是酶切时候产生新号活性，把pcr产物错切了一段。你可以看看少了的片段的末尾，是否和限制酶的识别位点比较相似。如果是的话，建议减少酶切时间和酶的用量，加大反应体系。

还有就是pcr产物里就有那个酶切位点。
赞一下 回复此楼
初来乍到，请多指教
2楼2015-08-07 00:54:07
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼上说的有点道理，这么多资料，找找看吧
http://www.detaibio.com/material-downloads.html
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
3楼2015-08-07 09:35:05
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