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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » SacI和HindIII离的这么近可以切开吗？
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biogefart

木虫 (著名写手)

[交流] SacI和HindIII离的这么近可以切开吗？

中间只有7个碱基。
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闹太套
1楼 2008-08-14 16:37:04
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chysx6

铁杆木虫 (小有名气)
★ ★ ★
reasonspare(金币+3,VIP+0):thx
4楼从热动力学分析很有道理
另补充几点
从酶本身的考虑：SacI和HindIII均属II型限切酶，酶识别反对称序列并结合于其上
进行切割，所以两个酶是否可以同时切割两个较接近的位点要看酶本身是否可结合
于这段序列，我们可以分析这两个酶的保护碱基数
HindIII：CCCAAGCTTGGG  酶切20h  切割率>75%
SacI   ：CGAGCTCG          酶切20h  切割率>10%
从楼主所给序列初步判断双切从距离上来说是没有问题的

从缓冲体系考虑：
Sac I 为低盐缓冲体系，当盐浓度高于10 mM时，Sac I 的活性被抑制。
HindIII为中盐缓冲体系，低离子强度条件可能会导致星活性。

以NEB酶为例
可使用 NEBuffer 1 + BSA先进行切割1-2h（在此条件下酶切效率100%），
再补HindIII（在此条件下酶切效率50%）进行切割
楼主可根据自己需要确定酶用量
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10楼2008-08-14 20:21:39
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普通回帖

jasco

木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
没有问题的，双切不行的话，就先sac I切再hind III切吧
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2楼2008-08-14 17:25:03
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董文娟

金虫 (小有名气)
★
reasonspare(金币+1,VIP+0):thx
请教楼上 如果双切不行，可能是什么原因造成的？
如果分两步切  在进行第二步切之前是否需进行DNA提取？？？
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3楼2008-08-14 17:59:26
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):楼主还有问题，你再看看。
热动力学原理，其实并不是酶就死死地结合在DNA的酶切位点上面的
一个切完走人另一个接着切
但也有同时binding到一个地方的情况出现，这时候如果离得比较近
那么互相直接可能会有位阻、电荷等的影响
分两步切的话，不需要再次进行DNA提取了
如果怕有星号活性的出现的话，切完一个，热灭活一个，然后温度复原，加第二个酶再切
当然前提是，两个酶所用的buffer是相同的，或者在这个buffer中，活性都能够得到保证
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4楼2008-08-14 18:23:10
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董文娟

金虫 (小有名气)
谢谢 再请教，分步切割的时间与双切一样么？
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5楼2008-08-14 18:35:48
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
分步切的话，就按照各个酶推荐的酶切条件以及酶切时间来做
就相当于两个单酶切的先后叠加
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6楼2008-08-14 18:37:33
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biogefart

木虫 (著名写手)

很专业 致敬！！

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-8-14 18:37:
分步切的话，就按照各个酶推荐的酶切条件以及酶切时间来做
就相当于两个单酶切的先后叠加

7楼2008-08-14 18:41:52
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
都不好意思了~~~~
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8楼2008-08-14 19:29:31
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mark32280667806

★ ★
reasonspare(金币+2,VIP+0):thx
可以切开
如果是双切了做载体的话，需要先切一下，然后回收，在切一下。（可以先用SCI1先切，然后用HIND3切）
赞一下(10人) 回复此楼
9楼2008-08-14 19:34:41
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