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tinychan

新虫 (初入文坛)

[交流] 染色体步移法扩增侧翼序列 已有4人参与

最近在做染色体步移法扩增侧翼序列，做了好多次，三轮PCR条带都是弥散的，用了TAKARA的试剂盒，也没有结果，技术说我的引物特异性不好，但是我设计的时候已经是没有错配的。请问引物设计有什么注意事项呀？是要在保守区设计吗？求大神支招！
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1楼 2015-07-29 18:22:52
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
看来你还是没有很好的理解walking技术啊

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2楼2015-07-29 19:32:52
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
不是昆虫就是鱼虾，冷门？

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3楼2015-07-29 19:53:43
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tinychan

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Neo2000 at 2015-07-29 19:32:52
看来你还是没有很好的理解walking技术啊

我用的是FPNI-PCR，采用的是一条随机引物和一条特异性引物进行热不对称反应进行侧翼序列扩增的，设计了巢式引物，但是三轮下来总是会有弥散，怎么办呢?
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4楼2015-07-29 22:44:02
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Neo2000

木虫 (著名写手)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by tinychan at 2015-07-29 22:44:02
我用的是FPNI-PCR，采用的是一条随机引物和一条特异性引物进行热不对称反应进行侧翼序列扩增的，设计了巢式引物，但是三轮下来总是会有弥散，怎么办呢?...

方法不得当，没结果就很正常了，你试试按试剂盒说明书做下

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5楼2015-07-30 07:58:54
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xiemin217

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
把的详细步骤发 出来，大家才这知道你错在哪里，按理第二部就要有条带，用盒子做都没有条带，可能没有明白说明书是什么意思。
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6楼2015-07-31 20:39:56
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tinychan

新虫 (初入文坛)
这是我最近两次做得，设计引物的时候按照严格的没有错配，没有二级结构。操作按照说明书做，但还是没有结果，而且在第三轮PCR的时候突然出现一条较大而且很亮的条带求大神赐教！
染色体步移法扩增侧翼序列
PS.1-3为AP1的第一、第二、第三轮PCR产物，每隔一个MARKER 是一组。

染色体步移法扩增侧翼序列-1
20150726gw2 copy.gif
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    • 2015-08-05 16:02:52, 598.96 K
7楼2015-08-05 16:03:42
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WANWAN515626

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by tinychan at 2015-08-05 16:03:42
这是我最近两次做得，设计引物的时候按照严格的没有错配，没有二级结构。操作按照说明书做，但还是没有结果，而且在第三轮PCR的时候突然出现一条较大而且很亮的条带求大神赐教！

PS.1-3为AP1的第一、第二、第三轮 ...

用FPNI-PCR法扩增第一轮没有结果是正常的，一般只有第三轮才会有结果，看你这结果还挺好的，条带的位置是你想要的话，你就做成功了啊
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8楼2016-03-11 17:58:00
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