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cohnii

银虫 (小有名气)

[交流] 关于TA克隆

请教大家:
我刚做分子生物学,准备利用18S鉴定一种真菌。
PCR产物做出来纯化后都很正常,差不多1800bp
将其连接到pMD 18-T载体上后
准备跑胶看看有没有连接成功
结果发现在4500条带的后面竟然有三四个条带
做了两遍连接,还是一样。
不知道是怎么回事?希望听听大家的看法和建议,先谢谢!
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mark32280667806

★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复,欢迎常来
你是抽质粒检测的还是直接用快速检测的方法检测的呢?如果是手抽质粒的话,有3-4条带都是正常的现象,分别代表超螺旋,线性和却可的质粒,若果是用快速检测的方法检测质粒(或者是用试剂盒抽的质粒),正常情况是两条带,好的情况是一条带!!!
2楼2008-08-09 14:10:25
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mark32280667806

若果有图的话,可以将图附上,也好更详细的帮你分析分析
3楼2008-08-09 14:11:07
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cohnii

银虫 (小有名气)

我是用连接产物跑的胶,觉得不正常,就没有往下面做
一般与T载体连接后应该有几条带呢?
附件是我的图,Marker是4500的
最前面的应该是我要连接的片段
后面条带太多了。。
4楼2008-08-09 14:35:38
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cohnii

银虫 (小有名气)

图没有传上去,网速太慢了
5楼2008-08-09 15:54:14
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exit147

木虫 (著名写手)

★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):谢谢耐心答复,欢迎常来
引用回帖:
Originally posted by cohnii at 2008-8-9 14:35:
我是用连接产物跑的胶,觉得不正常,就没有往下面做
一般与T载体连接后应该有几条带呢?
附件是我的图,Marker是4500的
最前面的应该是我要连接的片段
后面条带太多了。。

我们实验室一般没有人连接后直接电泳检测的,正常程序是转化后提质粒跑胶验证,或者菌落pcr验证
秋风生渭水,落叶满长安。
6楼2008-08-09 16:13:34
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exit147

木虫 (著名写手)

“在4500条带的后面竟然有三四个条带"

从没见过这样的情况,真奇怪,转化大肠杆菌很快的,你转化之后,在检测试试

后面的条带会会是多个片段和载体连一起了,或者连成线状了?我猜的。
秋风生渭水,落叶满长安。
7楼2008-08-09 16:19:03
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darkblue111

铜虫 (初入文坛)

直接转化,涂平板不就知道连没连上了,浪费也就浪费一天时间
8楼2008-08-09 17:54:44
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cohnii

银虫 (小有名气)

再把电泳图传一下
9楼2008-08-09 19:48:29
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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.

很明显,你的连接发生了自连现象,可能你的片段不够纯的原因吧!建议你做完连接后做转化,在切下来纯化后做连接。理论上你的做法是可以找到你需要的东西的,但是在实际中,当片段不够纯的时候,自连现象很严重,而且很少能找到你需要的东西
多点思维,多点idea
10楼2008-09-13 03:08:42
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