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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 关于TA克隆
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cohnii

银虫 (小有名气)

[交流] 关于TA克隆

请教大家：
我刚做分子生物学，准备利用18S鉴定一种真菌。
PCR产物做出来纯化后都很正常，差不多1800bp
将其连接到pMD 18-T载体上后
准备跑胶看看有没有连接成功
结果发现在4500条带的后面竟然有三四个条带
做了两遍连接，还是一样。
不知道是怎么回事？希望听听大家的看法和建议，先谢谢！
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1楼 2008-08-09 13:51:37
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mark32280667806

★ ★ ★
xyklmu(金币+3,VIP+0):感谢答复，欢迎常来
你是抽质粒检测的还是直接用快速检测的方法检测的呢？如果是手抽质粒的话，有3-4条带都是正常的现象，分别代表超螺旋，线性和却可的质粒，若果是用快速检测的方法检测质粒（或者是用试剂盒抽的质粒），正常情况是两条带，好的情况是一条带！！！
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2楼2008-08-09 14:10:25
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mark32280667806

若果有图的话，可以将图附上，也好更详细的帮你分析分析
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3楼2008-08-09 14:11:07
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cohnii

银虫 (小有名气)
我是用连接产物跑的胶，觉得不正常，就没有往下面做
一般与T载体连接后应该有几条带呢？
附件是我的图，Marker是4500的
最前面的应该是我要连接的片段
后面条带太多了。。
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4楼2008-08-09 14:35:38
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cohnii

银虫 (小有名气)
图没有传上去，网速太慢了
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5楼2008-08-09 15:54:14
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exit147

木虫 (著名写手)
★ ★
xyklmu(金币+2,VIP+0):谢谢耐心答复，欢迎常来
引用回帖:
Originally posted by cohnii at 2008-8-9 14:35:
我是用连接产物跑的胶，觉得不正常，就没有往下面做
一般与T载体连接后应该有几条带呢？
附件是我的图，Marker是4500的
最前面的应该是我要连接的片段
后面条带太多了。。

我们实验室一般没有人连接后直接电泳检测的，正常程序是转化后提质粒跑胶验证，或者菌落pcr验证
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秋风生渭水，落叶满长安。
6楼2008-08-09 16:13:34
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exit147

木虫 (著名写手)
“在4500条带的后面竟然有三四个条带"

从没见过这样的情况，真奇怪，转化大肠杆菌很快的，你转化之后，在检测试试

后面的条带会会是多个片段和载体连一起了，或者连成线状了？我猜的。
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秋风生渭水，落叶满长安。
7楼2008-08-09 16:19:03
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darkblue111

铜虫 (初入文坛)
直接转化，涂平板不就知道连没连上了，浪费也就浪费一天时间
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8楼2008-08-09 17:54:44
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cohnii

银虫 (小有名气)
再把电泳图传一下
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9楼2008-08-09 19:48:29
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peng5053

银虫 (正式写手)

Dr.
很明显，你的连接发生了自连现象，可能你的片段不够纯的原因吧！建议你做完连接后做转化，在切下来纯化后做连接。理论上你的做法是可以找到你需要的东西的，但是在实际中，当片段不够纯的时候，自连现象很严重，而且很少能找到你需要的东西
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多点思维，多点idea
10楼2008-09-13 03:08:42
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