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laqiwe铁虫 (正式写手)
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[求助]
去垢剂CHAPS纯化毕赤酵母表达的膜蛋白已有1人参与
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| 在毕赤酵母中表达一膜蛋白，能够用DDM和TritonX-100纯化，但当用2%CHAPS(30-40mM,CMC为8mM)溶解酵母膜碎片时，发现不能将膜蛋白溶解下来，文献中有报道更低浓度CHAPS（5-30mM）溶解其它膜蛋白的案例，不知道为什么我这个浓度的却无法将膜蛋白溶下来。 |
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7楼2016-03-19 12:26:23
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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去垢剂CHAPS解其它膜蛋白的案例主要是对intracullular compartment的报道，是细胞内膜泡中小分子的溶解，对于跨膜蛋白的溶解，按照跨膜次数需要加入其他的去垢剂去补充。 就我本人的经验，GPCR中的七个跨膜的蛋白，从哺乳动物细胞中分离，加入少量的SDS是关键，Igpal 或者 NP40要好于TritonX100，在IP实验中效果较好，活性试验不敢说。 根据实验目的的不同，采用不同的lysis buffer菜单配方。分级分离后再抽提是一个可选择的方案，但是增加了实验的步骤和时间。 对于你所说的酵母表达的膜蛋白，情况与哺乳动物细胞表达的又不一样。因为酵母膜外有基质成分，需要加入破坏基质的试剂。具体参见http://www.protocol-online.org/prot/Model_Organisms/Yeast/Protein/ |
2楼2015-07-20 00:09:21
3楼2015-10-27 21:21:27
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The concentration of detergent is limited and normally no more than 2%, if the lysis buffer is dissolving completely, the phenomena of detergent precipitation can be avoided at 4 celcius degree. I do not know whether or not the occurred precipitations are detergents, as the membrane proteins, the preserved period is less than three days at 4 celcius degree, may be more concentration of salt in lysis buffer better than increase the stable time of proteins according to different protein characteristics. |
4楼2015-10-28 21:47:38