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laqiwe铁虫 (正式写手)
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[求助]
去垢剂CHAPS纯化毕赤酵母表达的膜蛋白 已有1人参与
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| 在毕赤酵母中表达一膜蛋白，能够用DDM和TritonX-100纯化，但当用2%CHAPS(30-40mM,CMC为8mM)溶解酵母膜碎片时，发现不能将膜蛋白溶解下来，文献中有报道更低浓度CHAPS（5-30mM）溶解其它膜蛋白的案例，不知道为什么我这个浓度的却无法将膜蛋白溶下来。 |
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【答案】应助回帖
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去垢剂CHAPS解其它膜蛋白的案例主要是对intracullular compartment的报道，是细胞内膜泡中小分子的溶解，对于跨膜蛋白的溶解，按照跨膜次数需要加入其他的去垢剂去补充。 就我本人的经验，GPCR中的七个跨膜的蛋白，从哺乳动物细胞中分离，加入少量的SDS是关键，Igpal 或者 NP40要好于TritonX100，在IP实验中效果较好，活性试验不敢说。 根据实验目的的不同，采用不同的lysis buffer菜单配方。分级分离后再抽提是一个可选择的方案，但是增加了实验的步骤和时间。 对于你所说的酵母表达的膜蛋白，情况与哺乳动物细胞表达的又不一样。因为酵母膜外有基质成分，需要加入破坏基质的试剂。具体参见http://www.protocol-online.org/prot/Model_Organisms/Yeast/Protein/ |
2楼2015-07-20 00:09:21
3楼2015-10-27 21:21:27
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The concentration of detergent is limited and normally no more than 2%, if the lysis buffer is dissolving completely, the phenomena of detergent precipitation can be avoided at 4 celcius degree. I do not know whether or not the occurred precipitations are detergents, as the membrane proteins, the preserved period is less than three days at 4 celcius degree, may be more concentration of salt in lysis buffer better than increase the stable time of proteins according to different protein characteristics. |
4楼2015-10-28 21:47:38
5楼2015-10-29 10:38:50
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Hence, protein purification need to be completed as soon as possible after you determine to do. The pro-experiment is necessary to a feasible plan in each experiment. On the other hand, the preserve condition and check point in the different also need to figure out before beside the bench. Experiments are designed out other than done out. If not, the overtime works have to be done. |
6楼2015-10-30 01:41:38
7楼2016-03-19 12:26:23
5