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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 去垢剂CHAPS纯化毕赤酵母表达的膜蛋白
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laqiwe

铁虫 (正式写手)

[求助] 去垢剂CHAPS纯化毕赤酵母表达的膜蛋白 已有1人参与

在毕赤酵母中表达一膜蛋白，能够用DDM和TritonX-100纯化，但当用2%CHAPS(30-40mM,CMC为8mM)溶解酵母膜碎片时，发现不能将膜蛋白溶解下来，文献中有报道更低浓度CHAPS（5-30mM）溶解其它膜蛋白的案例，不知道为什么我这个浓度的却无法将膜蛋白溶下来。
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1楼 2015-07-17 21:44:55
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holyhawk

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
去垢剂CHAPS解其它膜蛋白的案例主要是对intracullular compartment的报道，是细胞内膜泡中小分子的溶解，对于跨膜蛋白的溶解，按照跨膜次数需要加入其他的去垢剂去补充。

就我本人的经验，GPCR中的七个跨膜的蛋白，从哺乳动物细胞中分离，加入少量的SDS是关键，Igpal 或者 NP40要好于TritonX100，在IP实验中效果较好，活性试验不敢说。

根据实验目的的不同，采用不同的lysis buffer菜单配方。分级分离后再抽提是一个可选择的方案，但是增加了实验的步骤和时间。

对于你所说的酵母表达的膜蛋白，情况与哺乳动物细胞表达的又不一样。因为酵母膜外有基质成分，需要加入破坏基质的试剂。具体参见http://www.protocol-online.org/prot/Model_Organisms/Yeast/Protein/
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2楼2015-07-20 00:09:21
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by holyhawk at 2015-07-20 00:09:21
去垢剂CHAPS解其它膜蛋白的案例主要是对intracullular compartment的报道，是细胞内膜泡中小分子的溶解，对于跨膜蛋白的溶解，按照跨膜次数需要加入其他的去垢剂去补充。

就我本人的经验，GPCR中的七个跨膜的蛋白 ...

你好。请问一下，用去垢剂溶解膜蛋白以后，在低温条件下，去垢剂会沉淀。例如上Ni柱纯化的时候，低温下，去垢剂就沉淀了。请问这个会对膜蛋白有影响吗？平常膜蛋白也保存在4℃的。
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3楼2015-10-27 21:21:27
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holyhawk

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xissy at 2015-10-27 21:21:27
你好。请问一下，用去垢剂溶解膜蛋白以后，在低温条件下，去垢剂会沉淀。例如上Ni柱纯化的时候，低温下，去垢剂就沉淀了。请问这个会对膜蛋白有影响吗？平常膜蛋白也保存在4℃的。...

The concentration of detergent is limited and normally no more than 2%, if the lysis buffer is dissolving completely, the phenomena of detergent precipitation can be avoided at  4 celcius degree. I do not know whether or not the occurred precipitations are detergents, as the membrane proteins, the preserved period is less than three days at 4 celcius degree, may be more concentration of salt in lysis buffer better than increase the stable time of proteins according to different protein characteristics.
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4楼2015-10-28 21:47:38
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xissy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by holyhawk at 2015-10-28 21:47:38
The concentration of detergent is limited and normally no more than 2%, if the lysis buffer is dissolving completely, the phenomena of detergent precipitation can be avoided at  4 celcius degree. I  ...

非常感谢！刚开始做膜蛋白，很多东西需要自己摸索，所以很多不懂。您说的膜蛋白在4℃情况下保存不超过3天的情况，我感觉实际操作有点困难呀。第一天我得到膜蛋白，然后需要筛选合适的溶解膜蛋白的去垢剂。然后纯化，纯化的时候可能去垢剂也需要替换为另一个去垢剂。溶解到去垢剂中的膜蛋白和柱材料孵育过夜。第二天纯化。这个中间的时间如果只能控制在3天的时间里太急了吧。

不好意思，很多不懂。
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5楼2015-10-29 10:38:50
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holyhawk

银虫 (初入文坛)
Hence, protein purification need to be completed as soon as possible after you determine to do. The pro-experiment is necessary to a feasible plan in each experiment.
On the other hand, the preserve condition and check point in the different also need to figure out before beside the bench. Experiments are designed out other than done out. If not, the overtime works have to be done.
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6楼2015-10-30 01:41:38
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zwl9426

新虫 (初入文坛)
楼主您好  我也是刚刚接触膜蛋白，但是我不做关于提纯的。只是研究蛋白质的折叠结构变化。  你知道如何溶解PMP22（peripheral myelinprotein 22）膜蛋白吗？很难溶解，所以
我自己加入了DPC（0.5%）和KPI（PH=7），没有加sds，最后还是不溶解，一直放在冰箱里！真的弄得头大啊！
谢谢了！
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7楼2016-03-19 12:26:23
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