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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » His-Tag纯化遇到的问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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s1g2k3

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] His-Tag纯化遇到的问题 已有3人参与

最近开始做蛋白的纯化，希望能拿到高纯度的酶，蛋白是可溶性表达，所以直接拿上清液做的Ni柱纯化，可是发现不挂住，标签是在N端，推测是His标签被包裹了，所以用8M尿素溶解，变成线性之后又做了纯化，发现可以纯化出来了，验证了我的推测。但是我要的是可溶性表达，我该怎么解决His标签被包含的问题呢？不能做复性，我要的量比较大，需要可溶性表达。

我查资料发现可以加自己设计加His的长度，如果有谁知道方法的话交流一下。我的质粒C端没有His标签，如果要加只能手动加，但是不知道怎么设计引物，因为在酶切位点之后了~
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知识总是多的学不完，但是真的艺不压身。
1楼 2015-07-14 09:50:47
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a86052

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在C端加His标签也不难啊，在下游引物蛋白序列后面加上6*His或者8*His的基因，加上终止密码，再加上酶切位点就可以了~没有试试N端的GST标签什么的？还有其他载体？
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2楼2015-07-14 17:05:08
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克隆大虾

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以换到蛋白质的羧基端试下，有可能解决该问题。
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3楼2015-07-14 17:52:40
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hc-material

新虫

【答案】应助回帖

可以不加HIS，直接表达，然后用离子交换或疏水层析纯化。祝实验顺利。
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4楼2015-08-25 11:37:18
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958695856

实习版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-07-14 17:05:08
在C端加His标签也不难啊，在下游引物蛋白序列后面加上6*His或者8*His的基因，加上终止密码，再加上酶切位点就可以了~没有试试N端的GST标签什么的？还有其他载体？

PET28a BL21 第一次构建时只留了一个标签 没有去除C端的终止密码子
又构建了一次 去掉终止密码子 又加了个标签 按说两个标签应该结合更牢固 （上清）纯化后目的蛋白还是没结合上 有的杂蛋白结合上了
我这个蛋白包涵体表达量很高 之前做过切胶纯化免疫小鼠 上清中也有目的蛋白 就是量少
怕后期做ELISA时 因为包涵体的缘故出现差错 想换成可溶性表达的

看到论坛中有的是加9个his标签

有没有大神支支招
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5楼2016-09-08 09:42:08
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