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ruan123456金虫 (小有名气)
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[求助]
抗体亲和力测定
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请问我实验遇到下面这种情况应该怎么办呢？请分析原因并提出解决方案。O(∩_∩)O谢谢！ 1，方法：抗体竟争结合抗原（ELISA） 2，抗原：200kd，从1000ng/ml倍比稀释（1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625,0） 3，细胞上清（间接ELISA检测：OD值达到2.4）：原液，稀释500倍，1000倍，2000倍，4000 4，过程：0.5μg/ml抗原包被（100μl/孔），4℃过夜，1%BSA封闭（200μl/孔，37℃,2h），酶标板经验证：阳性正常，阴性正常。细胞上清稀释液和抗原梯度稀释液各60μl混合于细胞培养板中，4℃过夜；吸取100μl/孔加入到抗原包被的板条中，37℃,1h后，将酶标板中的混合液转到另一块相同酶标板中，作为平衡板；洗板，100μl/孔加入HRP标记二抗，37℃，30min;洗板，显色。结果：细胞上清原液OD值均在2.0以上，变化无规律，500倍及更高倍稀释液几乎不显色；平衡板结果与原板基本无差别。平行试验：细胞上清稀释液和抗原梯度稀释液各60μl混合于抗原包被板中（酶标板），37℃,1h后，将酶标板中的混合液转到另一块相同酶标板中，作为平衡板；洗板，100μl/孔加入HRP标记二抗，37℃，30min;洗板，显色。结果：细胞上清原液OD值均在2.0以上，变化无规律，500倍及更高倍稀释液几乎不显色；平衡板结果与原板基本无差别。重复以上步骤，结果无变化。 |
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2015-07-03 13:04:27, 11.46 K
4楼2015-07-03 13:05:31
【答案】应助回帖
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ruan123456: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-07-01 15:37:21
ruan123456: 金币+50, ★★★很有帮助 2015-07-01 15:37:21
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首先，比较抗体亲和力，简简单单测个效价就ok了！ 其次就你的实验设计有几点要说的： 1.你用竞争首先要保证竞争物和抗体只有一个是变量，才能看出竞争趋势（你的同一个实验抗原与上清都是变量） 2.做竞争时竞争物浓度需要一定的摸索(不要期望一个实验就完事），最好对结果有目标--最低检出限，不能说竞争物特别多有竞争，那么抗体也没用。 3.抗原分子量太大不建议做竞争，会有空间位阻，呈现假阳性。 4.不知道你这个抗体是单抗还是多抗，多抗做竞争不如单抗，位点太多。 |
2楼2015-06-29 22:22:18
ruan123456
金虫 (小有名气)
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3楼2015-07-01 15:36:07
ruan123456
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5楼2015-07-21 16:23:21
50