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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 酶连
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xh446063

新虫 (小有名气)

[求助] 酶连已有3人参与

请教各位

      我最近在用TAKARA的T4 DNA连接酶做载体（6.5kb）和目的片段（0.5kb）的连接，但是翻看了一下说明书，没有推荐反应体系，不知道怎样的配比才能提高连接效率，请各位指点迷津，另外大家都在用什么反应条件，我看有37℃，16℃和4℃，哪个方法高效快捷呢？谢谢
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1楼2015-06-11 14:58:40
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xh446063: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-06-19 19:15:30
将载体和目的片段都提取好之后测浓度，两种的摩尔比1:3-1:10直接都可以，连接温度16度的效果可能比较好一点
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医学&统计学
2楼2015-06-14 13:23:01
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ultimica

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xh446063: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-06-19 19:16:48
我个人常用的连接体系如下：
目的片段酶切产物           6微升
质粒载体酶切产物           2微升
ddH2O                         4微升
T4 连接酶10X Buffer    1.5微升
T4 连接酶                   1.5微升
其中可根据测的目的片段和质粒载体酶切产物的浓度调整摩尔体积，总比例为载体：目的片段=1:3~1:9，和楼上推荐的基本没差，其余用水补全，共计15微升体系，16℃水浴连接过夜，望采纳。
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3楼2015-06-16 10:26:20
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露露琦琦

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xh446063: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-06-19 19:16:54
体系跟 楼上都差不多啦，不过我一般都是室温2小时后转化，效果不错。
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4楼2015-06-16 10:28:57
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xh446063

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-06-14 13:23:01
将载体和目的片段都提取好之后测浓度，两种的摩尔比1:3-1:10直接都可以，连接温度16度的效果可能比较好一点

谢谢您的回复，我要再调整一下我的反应体系
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5楼2015-06-19 19:17:41
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xh446063

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ultimica at 2015-06-16 10:26:20
我个人常用的连接体系如下：
目的片段酶切产物           6微升
质粒载体酶切产物           2微升
ddH2O                         4微升
T4 连接酶10X Buffer    1.5微升
T4 连接酶                   1.5微升 ...

谢谢您的回复，根据您的回复我再尝试一下
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6楼2015-06-19 19:18:47
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xh446063

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 露露琦琦 at 2015-06-16 10:28:57
体系跟 楼上都差不多啦，不过我一般都是室温2小时后转化，效果不错。

谢谢您的帮助，我可以做个室温下反应的，室温反应好快啊
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7楼2015-06-19 19:20:09
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geyihui

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-06-14 13:23:01
将载体和目的片段都提取好之后测浓度，两种的摩尔比1:3-1:10直接都可以，连接温度16度的效果可能比较好一点

就是用浓度除以相应碱基数吗，得到对应的摩尔比吗，16度过夜链接吗。最近在电转建库，连接效率一直不高，再问一下，是不是片段浓度太高，酶切效率就不高
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8楼2015-07-21 10:09:46
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雪糕哦

新虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ultimica at 2015-06-16 10:26:20
我个人常用的连接体系如下：
目的片段酶切产物           6微升
质粒载体酶切产物           2微升
ddH2O                         4微升
T4 连接酶10X Buffer    1.5微升
T4 连接酶                   1.5微升 ...

请问你用的是Takara 2011A的吗？我用TAKARA T4连接酶，一直连不上。

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9楼2017-03-17 15:54:29
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