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xh446063

新虫 (小有名气)

[求助] 酶连已有3人参与

请教各位

      我最近在用TAKARA的T4 DNA连接酶做载体(6.5kb)和目的片段(0.5kb)的连接,但是翻看了一下说明书,没有推荐反应体系,不知道怎样的配比才能提高连接效率,请各位指点迷津,另外大家都在用什么反应条件,我看有37℃,16℃和4℃,哪个方法高效快捷呢?谢谢
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xh446063

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 董博士 at 2015-06-14 13:23:01
将载体和目的片段都提取好之后测浓度,两种的摩尔比1:3-1:10直接都可以,连接温度16度的效果可能比较好一点

谢谢您的回复,我要再调整一下我的反应体系
5楼2015-06-19 19:17:41
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董博士

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xh446063: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-06-19 19:15:30
将载体和目的片段都提取好之后测浓度,两种的摩尔比1:3-1:10直接都可以,连接温度16度的效果可能比较好一点
医学&统计学
2楼2015-06-14 13:23:01
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ultimica

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xh446063: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-06-19 19:16:48
我个人常用的连接体系如下:
目的片段酶切产物           6微升
质粒载体酶切产物           2微升
ddH2O                         4微升
T4 连接酶10X Buffer    1.5微升
T4 连接酶                   1.5微升
其中可根据测的目的片段和质粒载体酶切产物的浓度调整摩尔体积,总比例为载体:目的片段=1:3~1:9,和楼上推荐的基本没差,其余用水补全,共计15微升体系,16℃水浴连接过夜,望采纳。
3楼2015-06-16 10:26:20
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露露琦琦

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xh446063: 金币+5, ★★★很有帮助 2015-06-19 19:16:54
体系跟 楼上都差不多啦,不过我一般都是室温2小时后转化,效果不错。
4楼2015-06-16 10:28:57
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